CCF20100324003

Wykonanie:

A. Izolacja mitochondriów

Do homogenizacji tkanki i izolacji mitochondriów używamy roztworów schłodzonych w lodówce!!!

5 g tkanki serca drobno pociąć nożyczkami i dodać 5 objętości (25 ml) 10 mM buforu fosforanowego o pH 6,7 zawierający: 0,25 M sacharozę, 1,8 mM CaCl₂ i ImM PMSF.

Naczynie z tkanką umieszczamy w lodzie i homogenizujemy w homogenizatorze nożykowym 3 razy po 30 sek. z 30 sekundowymi przerwami.

Uzyskany homogenat sączymy przez 4 warstwy gazy. Do oznaczeń aktywności DB i białka pobieramy lml homogenatu. Pozostałą część i wirujemy przez lOmin przy 1000xg. Supematant delikatnie dekantujemy i ponownie wirujemy przez 20min. przy 10 000xg. Uzyskany osad (w literaturze określany jako frakcja 10P) zawiera mitochondria Osad ten zawieszamy w 4 ml 50mM bufom Tris-HCl pH 7,6 z 0.32 M sacharoza. 4 mM CaCl₂ i 25 mM KC1). Do oznaczeń pobieramy lml tej frakcji. Pozostałą część zawiesiny wirujemy jak wyżej. Osad, który zawiera oczyszczone mitochondria zawieszamy w lml 50 mM buforu Tris-HCl pH 7,6. We wszystkich uzyskanych frakcjach oznaczamy stężenie białka i aktywność dehydrogenazy.

B.    Obliczanie szybkości obrotów wirówki/ niezbędnej do uzyskania stosownej siły odśrodkowej - g.

Przy obliczaniu liczby obrotów wirówki niezbędnych do uzyskania stosownego do badań wartości przyspieszenia stosujemy poniższy wzór.

Przyspieszenie - g ( Względna siła odśrodkowa) = (11,4 x 10'⁶) x r x /"

r = promień wirnika - 9,5 cm

X = liczba obrotów/ min

11,2 x 10'° = szybkość kątowa

C.    Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej

Do oznaczeń aktywności dehydrogenazy- bursztynianowej stosujemy metodę, w której akceptorem wodoru jest chlorek jodo-nitro-tetrazoliowy. Dehydrogenaza redukuje ten związek do formazanu zgodnie z reakcją (Ryc. 2). Powstający w tej reakcji INT-formazan jest związkiem barwnym absorbującym światło o długości fali X = 470 nm.

Ryc. 2. Redukcja chlorku jodo-nitro-tetrazoliowego (INT) do barwnego formazanu przez FADH₂ powstający w reakcji utleniania bursztynianu z udziałem dehydrogenazy bursztynianowej.