CCF20121026010

4. Wykrywanie kwasu fosforowego

Wykonanie:

Do 0,5 cm³ hydrolizatu kwasów nukleinowych dodać roztworu amoniaku (NH₄OH), aż roztwór stanie się alkaliczny. Następnie zakwasić stężonym HN0₃ i dodać około 4 cm³ molibdenianu amonu. Ogrzać do wrzenia. Pojawia się żółty osad fosforomolibdenianu amonu.

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Przygotować 1% żel agarozowy.

W tym celu należy rozpuścić 0,4 g agarozy w 40 ml buforu 0,5% TBE.( żel na 17 próbek) Rozpuszczać ostrożnie w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia.

Ostudzić agarozę i gdy osiągnie temperaturę około 60°C dodać 2 pi bromku etydyny (10 mg/ml). Wylać żel na płytkę i pozostawić do zastygnięcia (~ 20 min).

Przygotować próbki:

1 (Jl RNA + 9 pi wody + 1 □ pl 5x Loading Dye Solution (Fermentas)

Bufor do elektroforezy 0,5 x TBE

Marker wielkości: gotowy -5 pl na żel Przygotowanie markera:    1 pl markera

1 pl 5x Loading Dye Solution,

4 pl wody

Nałożyć próbki na żel. Prowadzić elektroforezę ok. 40 min. Żel wizualizować w świetle UV. Odróżnianie DNA od RNA Reakcja orcynolowa

Ryboza wolna oraz związana w nukleozydach ogrzewana ze stężonym HC1 przechodzi w furfiiral, który z orcyną i jonami Fe³⁺ tworzy trwały kompleks o ciemno-zielonym zabarwieniu.

Wykonanie:

Do jednej probówki wlać 1 ml 0,1% roztworu RNA, a do drugiej 1 ml 0,1% roztworu DNA. Następnie do obydwóch probówek dodać 1 ml odczynnika orcynolowego i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na około 15 min. W probówce zawierającej RNA powstaje ciemno-zielone zabarwienie, probówka z DNA pozostaje jasno-zielona (reakcja negatywna).

28