62

3. Hydroliza kwasu deoksyrybonukleinowego niezbędna do przeprowadzenia reakcji na obecność tyminy i kwasu ortofosforowego. Do probówki zawierającej 2 mi roztworu kwasu nukleinowego w 0,1-molowym wodorotlenku sodowym dodać 2 ml kwasu nadchlorowego (3). Wykonać równoległą próbę kontrolną, dodając do drugiej probówki 2 ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego (2 ) i 2 ml kwasu nadchlorowego (3 ). Hydrolizę prowadzić we wrzącej łaźni wodnej w ciągu 1 godziny.

Po zakończonej hydrolizie odmierzyć do jednej probówki 2 ml hydrolizatu, a do drugiej probówki 2 ml roztworu próby kontrolnej. Zobojętnić obie próby, dodając 1,5 ml 5-molowego wodorotlenku sodowego (7 ); (roztwór powinien wykazywać pH 7-8). Roztworów' tych używ^rać do wykonywania reakcji na obecność tyminy.

Pozostałe nie zobojętnione 2 ml hydrolizatu i 2 ml próby kontrolnej rozcieńczyć dodając do każdej z nich po 4 ml wody i stosować do wykrywania kwasu ortofosforowego.

3a. Reakcja na wykrywanie tyminy. Do dwu probówek odmierzyć po 2,5 ml roztworu w^ręglanu sodowego (8) i po 1 ml odczynnika diazow'ego (9). Do jednej z tych probówek dodać 0,5 ml zobojętnionego hydrolizatu kwasów nukleinowych, a do drugiej 0,5 ml zobojętnionego roztworu próby kontrolnej. Po 5 min do obu probówek dodać po 1 ml 3-molowego wodorotlenku sodowego (10 ) i 2 lub 3 krople hydroksyloaminy (11 ). Po 5 min obserwować intensywność zabawienia roztworu.

3b. Reakcja na wykrywanie kwasu fosforowego. Do jednej probówki odmierzyć 1 ml kwaśnego hydrolizatu kwasów nukleinowych, a do drugiej 1 ml próby kontrolnej (punkt 3). Dodać do obydwu probówek po 2 ml roztworu molidbenianu amonowego (6 ).

Opracowanie wyników

Podać, jakie uzyskano zabarwienie po przeprowadzeniu poszczególnych reakcji ze składnikami kwasów' deoksyrybonukleinowych wraz z uzasadnieniem. Wyjaśnić celow^rość wykonywania prób kontrolnych.

Ćwiczenie 8.

Oznaczanie zawartości DNA w materiale zwierzęcym'^}

Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu studentów' z metodą oznaczenia zawartości DNA w' materiale biologicznym opartą na powszechnie stosowanym oznaczeniu ^-D-2-deoksyry-bozy (reakcja Dischego) obecnej w tym związku.

Wprowadzenie

Większość metod chemicznych oznaczania zawartości kwasów nukleinowych w tkankach polega na określeniu ilości fosforu lub cukru albo ilości zasad azotowych. Można w' tym celu wykorzystać reakcje barwne charakterystyczne dla tych związków opisane w^r ćwiczeniu