SNC02075

Magdalena Widuch GS 26

Ćwiczenie nr 2

Immobilizacja inwertazy na CM-Sephadex

Immobilizowane enzymy pełnią istotną rolę w procesach biotechnologicznych ze względu na możliwość wielokrotnego wykorzystania a także większą stabilność

Celem ćwiczenia jest zapoznanie z metodami immobilizacji inwertazy na podłożu organicznym o budowie polisacharydowej oraz zbadanie wpływu niektórych parametrów na wydajność reakcji

Jako nośnik użyto CM-Sephadex, który jest zmodyfikowanym dekstranem w formie kuleczek. Posiada grupy karboksymetylowe przyłączone wiązaniem eterowym do jednostek glukozowych dekstranu, co sprawia, że CM-Sephadex jest słabo kwaśnym kationitem. Enzym immobilizowano metodą fizyczną ( został związany z nośnikiem wiązaniami jonowymi). Proces przeprowadzono w reaktorze porcjowym z mieszaniem.

100 mg nośnika zalano buforem do immobilizacji i pozostawiono na trzy dni w temperaturze pokojowej celem spęcznienia. Następnie umieszczono go w probówce ze szlifem, dodano 0,05 ml inwertazy i mieszano przez godzinę w temp. 4°C. Nośnik z zaadsorbowanym enzymem odsączono, przemyto na sączku a przesącze zachowano do analizy.

Następnie zmierzono aktywność wolnej inwertazy. W tym celu do probówki zawierającej 1 ml 0,2 molowego roztworu sacharozy ogrzanej do temp. 37°C dodano 1 ml 1000-krotnie rozcieńczonej inwertazy i inkubowano w temp. 37°C. Pobrano trzy próbki: po 4, 6 i 8 minutach. W każdej z nich oznaczono koloiymetrycznie zawartość cukrów redukujących po reakcji z odczynnikiem miedziowym:

Próbka	Absorbancja
4’	0.85
6’	1,55
8’	2,8

AAs-4- = 2,8 - 0,85 = 1,95

Absorbancji 1,95 odpowiada 2,86 praola cukrów.

2,86 pmola cukrów red /2 =1,43 pmola sacharozy

1,43 pmola sacharozy/4 min = 0,3575 pmola sacharozy/min (U)

0,3575 pmola/min * 10 = 3,575 pmol/min 3,575 pmol/min * 1000 = 3575 pmol/min 3575 pmol/min * 0,05 = 178,75 pmol/min 178,75 pmol/min • 10 g = 17S7.5 U/g

Aktywność wolnej inwerazy wynosi 1787,5 U/g. Miarą aktywności jest szybkość powstawania cukrOw redukującycha jednostkę aktywności enzymu przyjmuje się ilość enzymu, która katalizuje rozkład 1 pmola sacharozy w czasie I minuty.