Skan2 bmp

U. Przebieg ć-yiczema;

Doświadczenie sl a da się z trzech etapów:

!. Izolacja DNA z liści ziemniaka 2, Amplifikaeja materiału gunelyc/ucgo

2. Rozdział cl; ktrotbrclyezny

1. IZOLACJA DNA

Izolację DNA należy przeprowadzić zmodytikowa ną metodą wysokosolną. Ulepszenie metody dotyczy dodatkowego zastosowania roztworów 1% merkaptoelanołu oraz 1% PVP zapewniających lepsze warunki izolacji DNA.

1.1 ODCZYNNIKI

•    Bufor 1:

-    0,4 MNaCl.

10 mM Iris- 1IC1 pil 8.0

-    2 mM liDTA pH 8.0

-    1 % merkapt¹' etanol

-    1% PVP MW 40000

•    20% SDS (końcowe stężenie 2%)

•    Proteinaza K ■ : stężeniu 20 nig/ml

•    CM NACI

•    izopropaitol

•    70% etanol

•    TE

-    1 mM Tris,

-    0,1 mMElT A pH 8.0

•    DNA izolowane ze świeżych liści ziemniaka:

1.2 POSTĘPOWANIE

Około 100 mg zamrożonej tkanki z młodych liści rozdrobnić w probówce Eppendorfa dopasowanym mc i iłowym tłoczkiem w 400 pi bufom 1.

Następnie dodać ; 0 pi 20% SDS (końcowe stężenie 2%) oraz 8 pi proteinazy K (końcowe stężenie 400pg/nń) i całość kilkukrotnie wymieszę. Próbki inknitować przez 1 godzinę w temperaturze 60^,:C, poczym dodane 300|.ig 6M NaCl i wytrząsać na worteksie na maksymalnej szybkości i żwirować ok. 30 minut przy prędkości 12.000 obr/min w wirówce.

Supematant przenieść do nowej probówki i wtrącić laku samą objętością zimnego izopropanolu (ok. 4°C). Następnie całość po delikatnym wymieszaniu inknbować przez noc w temp. *20^UC, Następnego dnia wirować wytrącony ONA przez 20 min. w 4^L'C przy 12.000 obr/min.

Otrzymany osad kwasów nukleinowych przemywać trzykrotnie 70% etanolem, suszyć w temp. 45°C (3-5 min.) i rozpuścić w 400j.il 0.1 x TE.

W celu oceny ilości i jakości wyizolowanego DNA, należy dokonać pomiarów adsorbancji przy pomocy spektrofotometru przy długości fal 230, 260 i 280nm, Ilość wyizolowanego DNA można określić przy 260nm, natomiast czystość na podstawie stosunku absorbaneji

Aj«|/A53().

2 AMPLIFIKACJA DNA

2.1    SKŁADNIKI MIESZANINY REAKCYJNEJ (na obj. 25_fxl)

•    Primcr, czyli startery o powtarz,alnvch sekwencjach

-0,6pM834:(AGvri’,

- 0,6 pM 841; (GA)_SCC » Bufor MgCij (2,5 mM),

•    Bufor 10 x stężony;

o Polimer aza Taq - 1 U/25 pL mieszaniny reakcyjnej

•    Roztwór dNTP (0.2 mM),

» DNA matrycowe (20 ng),

•    H₂0 sterylna do objętości końcowej 25 ul.

2.2    WARUNKI AMPLIFIKACJI DNA

Po przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej, reakcja przebiega w termocyklerze w warunkach:

1.    94^(IC (2 min)

2.    Dodawanie polimerazy w 4°C (w bloku z lodem),

3.    94"C (1 min) 4- 55°C (2 min) + 72° (3Os) x 30 cykli

4.    72^1,C (5 min)

3 ELEKTROFOREZA i ANALIZA PRODUKTÓW PCR

Po namnożeniu odcinków DNA w procesie amplifikacji, należy przeprowadzić rozdział uzyskanych produktów' reakcji PCR na drodze elektroforezy. W tym celu należy przygotować 2%) żel agarozowy i umieścić w specjalnie przygotowanych zagłębieniach w żelu zamplilikowane próbki i tak sporządzoną całość umieścić aparacie do elektroforezy.

Rozdzielone w żelu produkty reakcji PCR należy barwić roztworem bromku elydyny (ok. 30 min.), a następnie dokonać obserwacji w' zakresie światła ultrafioletowego.