Doświadczenie sl a da się z trzech etapów:
!. Izolacja DNA z liści ziemniaka 2, Amplifikaeja materiału gunelyc/ucgo
2. Rozdział cl; ktrotbrclyezny
Izolację DNA należy przeprowadzić zmodytikowa ną metodą wysokosolną. Ulepszenie metody dotyczy dodatkowego zastosowania roztworów 1% merkaptoelanołu oraz 1% PVP zapewniających lepsze warunki izolacji DNA.
• Bufor 1:
- 0,4 MNaCl.
10 mM Iris- 1IC1 pil 8.0
- 2 mM liDTA pH 8.0
- 1 % merkapt1' etanol
- 1% PVP MW 40000
• 20% SDS (końcowe stężenie 2%)
• Proteinaza K ■ : stężeniu 20 nig/ml
• CM NACI
• izopropaitol
• 70% etanol
• TE
- 1 mM Tris,
- 0,1 mMElT A pH 8.0
• DNA izolowane ze świeżych liści ziemniaka:
Około 100 mg zamrożonej tkanki z młodych liści rozdrobnić w probówce Eppendorfa dopasowanym mc i iłowym tłoczkiem w 400 pi bufom 1.
Następnie dodać ; 0 pi 20% SDS (końcowe stężenie 2%) oraz 8 pi proteinazy K (końcowe stężenie 400pg/nń) i całość kilkukrotnie wymieszę. Próbki inknitować przez 1 godzinę w temperaturze 60,:C, poczym dodane 300|.ig 6M NaCl i wytrząsać na worteksie na maksymalnej szybkości i żwirować ok. 30 minut przy prędkości 12.000 obr/min w wirówce.
Supematant przenieść do nowej probówki i wtrącić laku samą objętością zimnego izopropanolu (ok. 4°C). Następnie całość po delikatnym wymieszaniu inknbować przez noc w temp. *20UC, Następnego dnia wirować wytrącony ONA przez 20 min. w 4L'C przy 12.000 obr/min.
Otrzymany osad kwasów nukleinowych przemywać trzykrotnie 70% etanolem, suszyć w temp. 45°C (3-5 min.) i rozpuścić w 400j.il 0.1 x TE.
W celu oceny ilości i jakości wyizolowanego DNA, należy dokonać pomiarów adsorbancji przy pomocy spektrofotometru przy długości fal 230, 260 i 280nm, Ilość wyizolowanego DNA można określić przy 260nm, natomiast czystość na podstawie stosunku absorbaneji
Aj«|/A53().
• Primcr, czyli startery o powtarz,alnvch sekwencjach
-0,6pM834:(AGvri’,
- 0,6 pM 841; (GA)SCC » Bufor MgCij (2,5 mM),
• Bufor 10 x stężony;
o Polimer aza Taq - 1 U/25 pL mieszaniny reakcyjnej
• Roztwór dNTP (0.2 mM),
» DNA matrycowe (20 ng),
• H20 sterylna do objętości końcowej 25 ul.
Po przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej, reakcja przebiega w termocyklerze w warunkach:
1. 94(IC (2 min)
2. Dodawanie polimerazy w 4°C (w bloku z lodem),
3. 94"C (1 min) 4- 55°C (2 min) + 72° (3Os) x 30 cykli
4. 721,C (5 min)
Po namnożeniu odcinków DNA w procesie amplifikacji, należy przeprowadzić rozdział uzyskanych produktów' reakcji PCR na drodze elektroforezy. W tym celu należy przygotować 2%) żel agarozowy i umieścić w specjalnie przygotowanych zagłębieniach w żelu zamplilikowane próbki i tak sporządzoną całość umieścić aparacie do elektroforezy.
Rozdzielone w żelu produkty reakcji PCR należy barwić roztworem bromku elydyny (ok. 30 min.), a następnie dokonać obserwacji w' zakresie światła ultrafioletowego.