Untitled 7

I.

I

r

przypadkiem markerów STS są specyficzne znaczniki ekspresji (EST). Reprezentują one znaną, unikatową sekwencję klonu cDNA, amplifikowaną dzięki starannie dobranym sekwencjom starterów. Posługiwanie się markerami EST daje pewność identyfikowania sekwencji kodującej jednego genu. Aby marker EST mógł spełniać to zadanie wobec matrycy stanowiącej genomowy DNA, miejsca hybrydyzacji starterów powinny znajdować się w obrębie eksonu.

Klasyczne markery STS wykazują na ogół niski stopień polimorfizmu, nie pozwalając na wykrycie różnic między sekwencjami allelicznymi ze względu na brak zróżnicowania długości amplifikowanych fragmentów. Pewną ozansę na detekcję form allelicznych daje rozdział produktów PCR metodami DGGE, SSCP lub ich trawienie enzymem restrykcyjnym (metoda PCR-RFLP). Sekwencje przerywników rozdzielających geny rRNA oraz sekwencje między genami tRNA są wykorzystywane t w badaniach filogenetycznych ze względu na polimorfizm ich długości, obserwowanv często tylko w relacjach międzygatunkowych. Polimorfizm ten jest wykrywany markerami STS, z użyciem starterów komplementarnych do znanych i konserwatywnych sekwencji genów kodujących rRNA lub tRNA.

proste sekwencje powtarzalne (SSR)

Genomy roślin wyższych charakteryzuje obecność licznych sekwencji powtórzeń tandemowych, wśród których szczególnie przydatne w projektach mapowania genomów są mikrosatelity, składające się z wielokrotnie powtórzonych krótkich i-5 pz) sekwencji typu (AT)_n, (A)_n(T)_n, (AG)_n(CT)„, (GAA)„, (GACA)_n itp. (ikrosatelity rozlokowane są równomiernie w dużej liczbie na wszystkich łiromosomach, wykazując silny polimorfizm pod względem długości, warun-owany różną liczbą powtórzeń sekwencji podstawowej. Każdy odcinek mikro-telitarny jest oflankowany unikatowymi sekwencjami, które można wykorzys-do projektowania specyficznych starterów. Amplifikowane sekwencje rosatelitarne tworzą grupę markerów określaną jako proste sekwencje rzalne (SSR), krótkie tandemowe powtórzenia (STR) lub STS (rys. 8.2.2). wstępna opracowania markerów SSR zakłada przeszukiwanie biblioteki omowej DNA z użyciem sond zawierających sekwencję mikrosatelitamą. Po

sekwencja L unikatowa flankująca DNA mikrosatelitamy

ACACA(CA) CACAC, GTGTGT(GT) GTGTGT

<-sekwencja-+■

mikrosatelilama

1

5'

sekwencja P unikatowa flankująca DNA mikrosatelitamy

PCR z użyciem starterów 20-24-nukleotydowych, komplementarnych do sekwencji flankujących

Mir

3 CACACA(CA) CACACAgg

GTGTGT(GT) GTGTGT i

Rys. 8.2.2. Istota-metody otrzymywania markerów SSR

4P1