66337 Scan4

28

nie posiadających wyspecjalizowanego zaplecza do przygotowywania materiałów i sprzętu do sterylizacji.

Przyczyną śmierci komórek drobnoustrojów podczas sterylizacji są przede wszystkim zmiany chemiczne w białkach oraz zniszczenie struktury błony komórkowej. W wysokiej temperaturze w środowisku suchym białka ulegają utlenieniu, w środowisku zawierającym wodę białka koagulują. Ten ostatni proces jest powodowany przez niższą temperaturę niż utlenianie białek. Należy pamiętać, że procesowi wyjaławiania podlegają materiały i produkty zawierające nie pojedyncze komórki drobnoustrojów, ale ich populacje. Działanie letalne wysokiej temperatury na taką populację występuje w określonym czasie; przyjmuje się, że śmierć poszczególnych osobników populacji następuje w tyra samym czasie, w konkretnej temperaturze. Odkładając na osi rzędnych wartość czasu, a na osi odciętych wartość temperatury, w której ma miejsce śmierć wszystkich komórek w danym środowisku, uzyskamy tzw. krzywą śmierci cieplnej drobnoustrojów (krzywa TDT - thermal clealh time curve). Każdy jej punkt informuje o minimalnym czasie potrzebnym do zabicia, populacji danego gatunku drobnoustrojów w konkretnej temperaturze i odwrotnie - jaka temperatura minimalna jest potrzebna do zniszczenia tej populacji w określonym czasie. Krzywa TDT pozwala również na określenie wartości czasu śmierci cieplnej w temperaturze odniesienia, tj. 65,6°C dla pasteryzacji i 121,0°C dla sterylizacji. Czas śmierci cieplnej oznacza się symbolem F i jego wartość dla danych drobnoustrojów podaje się w minutach. Drugim parametrem sterylizacji jest wartość informująca o tzw. względnej ciepłooporności drobnoustrojów, określana przez niektórych autorów jako współczynnik ciepłooporności drobnoustrojów. Odczytuje się go również z krzywej TDT, gdyż wartość tę charakteryzuje nachylenie tej krzywej. Sporządzając krzywą TDT dla populacji danego gatunku drobnoustrojów zakładamy, że śmierć wszystkich jej komórek nastąpi w określonym, czasie i temperaturze. Wiemy jednak, że komórki giną w pewnym przedziale czasowym - najpierw najwrażliwsze, potem bardziej oporne na działanie temperatury. Dlatego też w procesie sterylizacji stosuje się ogrzewanie w stałej temperaturze przez określony czas. W tym czasie wzrasta liczba komórek wymierających, ponadto w tej samej jednostce czasu wymiera zawsze ten sam procent populacji drobnoustrojów. Redukcja liczby drobnoustrojów o 90% określana jest również jako redukcja o jeden cykl logarytmiczny. Jest to tzw. decymalna redukcja liczby drobnoustrojów oznaczona symbolem D. Wartość D = 1. oznacza więc redukcję liczby drobnoustrojów o 90%, D = 2 o 99% i D = 3 o 99,9%. Wartość D można wyznaczyć sporządzając tzw. krzywą przeżycia drobnoustrojów podczas wyjaławiania; obrazuje ona zależność liczby drobnoustrojów od czasu sterylizacji w danej temperaturze. Krzywa ta pokazuje nam, iż nie istnieją takie warunki, temperaturowo-czasowe, w których wystąpi śmierć całej

populacji drobnoustrojów. Wraz z przedłużaniem czasu wyjaławiania liczba komórek drobnoustrojów maleje, dążąc do nieskończoności. Należy więc pamiętać, że im liczniejsza populacja drobnoustrojów w wyjaławianym materiale, tym dłuższy musi być czas potrzebny do jej zniszczenia termicznego, do określonego poziomu D. Znajomość dynamiki procesów sterylizacji ma szczególne znaczenie wtedy, kiedy są one wykorzystywane na skalę technologiczną, np. przy sterylizacji środków żywnościowych, leczniczych itp. Warto również pamiętać, że efektywność sterylizacji zależy od wielkości sterylizowanego produktu (kolby z podłożami, probówki z solą fizjologiczną), jego rodzaju (woda w kolbie, konserwa mięsna) oraz ułożenia go w autoklawie. Czynniki te wpływają na szybkość nagrzewania wyjaławianego materiału.

4.1.3. Sterylizacja przez sączenie (filtrowanie)

Niektóre pożywki, bufory, płyny ustrojowe (np. surowice) i roztwory (np. kwaśny węglan sodu) nie mogą być wyjałowione termicznie, gdyż ich składniki ulegają zniszczeniu w wysokiej temperaturze. W takim przypadku stosuje się mechaniczną metodę sterylizacji - sączenie przez filtry o średnicy porów mniejszej od średnicy bakterii, najczęściej 0,2 i 0,45 fjm. Przez tak małe otwory w filtrze płyn przemieszcza się z trudem, w związku z tym należy stosować podciśnienie (uzyskiwane za pomocą pompki wodnej lub pompy olejowej) lub nadciśnienie (w filtrach strzykawkowych). Filtry mikrobiologiczne działają nie tylko na zasadzie sita mechanicznego, ale także przez adsorpcję cząstek sączonych na ścianach porów. Skuteczność sączenia mikrobiologicznego zależy nie tylko od wielkości bakterii, ale także ich ładunku elektrycznego, budowy powierzchni oraz powierzchni porów filtrów.

Typowy zestaw do sączenia składa się z kolby próżniowej, w której umieszcza się filtr bakteriologiczny. Całość zabezpiecza się przed kontaminacją drobnoustrojami z zewnątrz i sterylizuje w autoklawie lub suszarce. Zestaw podłącza się do pompy próżniowej, najlepiej poprzedzonej płuczką. W przeszłości stosowano wiele odmian filtrów mikrobiologicznych (Chambcrłanda, Berkefelda, Scitza, Shotta) o różnym przeznaczeniu i wielkości. Dziś sączenie mikrobiologiczne zdominowane zostało przez filtry membranowe, a ultra-fiłtracja za ich pomocą pozwala na oddzielenie z sączonego płynu cząstek o bardzo małych rozmiarach. W praktyce mikrobiologicznej stosuje się sączki z nitrocelulozy lub octanu celulozy. Ich zaletą jest to, że mogą być sterylizowane w autoklawie (po umieszczeniu w wodzie). Obecnie używa się różnych zestawów do sączenia bakterii za pomocą filtrów membranowych. Większe objętości płynów wyjaławia się za pomocą zestawów składających