10426 skanuj0005

A, W YBACZENIE WIDMA ABSORPCYJNEGO DLA NAD⁺1NADH+H⁴

Odczynniki:

•    0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0 i pH 6,5

•    roztwór podstawowy (0,2 mM) NAD⁺ w buforze fosforanowym o pH 6,5

•    roztwór podstawowy (0,2 mM) NADH + H* w buforze fosforanowym o pH 9,0

Wykonanie:

Dokonać pomiarów absorbancji 0,1 mM roztworu NAD⁺w zakresie widma 220-440 nm. Pomiary wykonać w kuwetach kwarcowych względem buforu fosforanowego o pH 6,5.

Podobnych pomiarów dokonać dla 0,1 mM roztworu NADH + H⁺ względem buforu o pH 9,0.

Na podstawie wykreślonego widma:

•    obliczyć teoretyczną wartość absorbancji 0,1 mM roztworu NADH + H⁺ przy 340 nm wiedząc, że molowy współczynnik absorpcji wynosi 6220

•    określić na tej podstawie stopień czystości (%) preparatu NADH + Hf¹" użytego'w doświadczeniu

B, WYKONANIE KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ DLA NADH +H+ METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ

Odczynniki:

•    0,05 M bufor fosforanowy pH 9,0

•    roztwór podstawowy (0,2 mM) NADH +

Wykonanie:

Z roztworu podstawowego (0,2 mM) NADH + H⁺, zawierającego 200 nmoli zredukowanego koenzymu w 1 ml, przygotować 6 rozcieńczeń do końcowej objętości 2 ml. Rozcieńczone roztwory powinny zawierać 20, 40, 60, 80, 100 i 150 nmoli NADH + Hr w 1 ml roztworu. Do rozcieńczania używać buforu fosforanowego o pH 9,0. Dokonać pomiarów absorbancji roztworów o rosnącym stężeniu NADH + H⁺ w 340 nm względem buforu używanego do rozcieńczeń.

•    Wykreślić krzywą wzorcową oraz obliczyć współczynnik kierunkowy.

3