30420 skanuj0012

K.3[Fe(CN)6] może być używany jako sztuczny akceptor elektronów pochodzących z PS II (Ryc. 4). W wyniku naświetlania wyizolowanych chloroplastów żelazicyjanek ulega redukcji do żelazo-cyjanku zgodnie z reakcją:

PS II + światło

4K.₃[Fe(CN)₆] + 4K⁺ + 2H₂0 -► 4 K₄[Fe(CM)_fl] i 4 FT i- 0₂

Redukcji żelazicyjanku towarzyszy spadek absorbancji mierzonej przy 420 nm. Mierząc zmiany absorbancji można obliczyć ilość nmoli powstałego żelazocyjanku w określonej jednostce czasu, w przeliczeniu na mg chlorofilu lub mg białka chloroplastowego.

Wykonanie:

Do 3 probówek wirówkowych napipetować po 1.5 ml zawiesiny chloroplastów (każda para pracuje oddzielnie!). W zaciemnionym pomieszczeniu, w warunkach przyciemnionego zielonego światła, dodać do każdej próby po 0.5 ml 6 mM roztworu K₃|Fe(CN)6). (UWAGA! Proszę zwrócić uwagę na dokładność pipetowania!). Próbę kontrolną umieścić w całkowitej ciemności (6 otwór w statywie), natomiast pozostałe 2 próby naświetlać rzutnikiem przez 2 i 4 minuty. W odpowiednim czasie reakcję hamować dodając do naświetlanych prób po 2 ml 10% roztworu TCA. Próby natychmiast dobrze wytrząsnąć i odstawić do statywu. Po zahamowaniu reakcji w 2 próbie (4 min naświetlania) dodać również 2 ml 10% TCA do próby kontrolnej (nienaświetlanej). Wytrącone białka odwirować przy 3000 obr/min. przez 10 minut. W celu dokonania pomiarów, do suchych probówek ściągnąć ostrożnie z nad osadu po około 2 ml klarownego (!) nadsączu i zmierzyć ab-sorbancję każdej próby względem wody destylowanej. (A, = 420nm). Wykreślić na papierze milimetrowym zmiany absorbancji w zależności od czasu naświetlania, a następnie zależność AA (absor-bancja próby kontrolnej minus absorbancja próby badanej) od czasu naświetlania kolejnych prób.

W obliczeniach stężenia powstającego w wyniku reakcji K4[Fe(CN)₆] przyjąć,wartość molowego współczynnika absorpcji dla K₃[Fe(CN)6] równą 1040. Obliczyć ilość K₄|Fe(CN)₆], wyrażoną w nmolach, powstającego w ciągu 60 min w warunkach wykonanego doświadczenia. W obliczeniach proszę uwzględnić objętość końcową prób wynoszącą 4 ml (2 ml mieszaniny reakcyjnej + 2 ml 10% TCA).

11