72943 skanuj0006

3.    Ustawiamy długość Mi na fc* 340 ma, zerujemy względem pustej kuwety.

4.    Mieszaninę reakcyjną wlewamy do kuwety, dodajemy 250 pl NADH w buforze (odczynnik R2) jednocześnie włączając stoper. Natychmiast notujemy wartość absorbancji (Ao),

a następnie JSkonujejii)' pomiarów co 1    do uzyskania stałej wartoMj^^i

W celu uzyskania liniowości oznaczeń zmiana absorbancji w ciągu minuty nie powinna przekraczać 0,150. Jeśli jest większą, próbę należy rc^ieńc^j^ |0-krotnie 0,*iffi& roztworem NaCl.

II. Elektroforetyczny rozdział izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej surowicy krwi WSTĘP

Ruchliwość białka w polu elektrycznym jĘj&f od wielkości ładunku, jaki niaitfc'^! W sobie cząsteczka, a jej ładunek zależy od punktu izoelektrycznego białka i pH roztworu,    białko

jest rozpuszczone. Białka różnią się punktami izoelektrycznymi, więc umieszczone w buforze o takim samym pH będą przesuwały się z różną szybkością do elektrody o ładunku przeciwnym do ładunku cząsteczki białka. Różnice w ruchliwości możemy oznaczyć denaturując (utrwalając) a następnie wybarwiając je odpowiednim barwnikiem np. czernią amidową lub ksiSS^jSąowym. W przypadku gdyąf^interestge nas ilość i jakość rozdzielonych białek fen katalityczna aktywność, wykonujemy tzw. zymogram. Zy mogramami nazywamy ulektreforogramy z wybarwioną swoistą dla badanego enzymu reakcją enzymatyczną. Pożądaną cechą takiej reakcji są nierozpuszczalne produkty. Takie produkty nie będą dyfundowały w nośniku podczas jego inkubacji, dzięki czemu obserwowane pasma będą miały stosunkowo ostre granice.

(A>							(B)	serce	nerki	erytrocyty	mózg	leukocyty	mięśnie	wątroba
IDH-l						■ O ■9	h4		SS33	SH	—	—	—	-^S
LDH-2				30	KO	aa	HjM	m8	■a	n	ira			—
LDH-3			99 93	99 39	99 a m		H2M2	—	ww	—	Mi	OBM	MBflBB	—
10H-4		99					HM3		—	—	—		—	—
IDH-5	99							—	—	—	—	—	Si	mm
	-9	-5	-i		-21	Aduit

Profil izoenzymów LDH zmienia się u szczura wraz $ wiekiem (B) Rozdział rlr1rtrrń|Hipti|jf ^enzymów LDH z różnych tkanek (według: J.M. Berg, L. Stryer. JX. Tj<fcoczko

biochemia”, PWN 2007).