270220121311

Ćwiczenie 3. Oporność osmotyczna erytrocytów

Błona komócfcowa jest Żywą. i złożoną strukturą w pełni przepuszczał da wody i wybiórczo przepuszczalną dla substancji rozpuszczonych — z nich przepuszcza łatwiej, inne trudniej, dla jeszcze innych zaś — jest nieocSL puszczam® Struktura błony jest dynamiczna, a jej przepuszczalność dla tej sam substancji może się zmieniać (np otwieranie i zamykanie kanałów jonowych?

Ponadto, poza bierną przepuszczalnością, błona komórkowa wyposażona te w biaftca nośnikowe, które transportują substancje zgodnie z gradientem stężeń oraz pompy - enzymy umożliwiające transport wbrew gradientowi stężeć.

W warunkach fizjologicznych, środowiska wewnątrzkomórkowe \ ze-wnsłnkomórkowe są na ogół Izoosmotyczne, choć ich skład jonowy może się różnić (np więcej K* wewnątrz komórek, więcej Na* w płynach pozakomótko-wych) Pomimo zdolności do osmoregulacji, w organizmie mogą występować przejściowe zmiany osmotyczne (związane ze zmianami ilości wody i soli mineralnych oraz ich przemieszczeniami w obrębie organizmu, np. w stresieY

Błona każdej zdrowej komórki ma więc określoną wytrzymałość mechaniczną na rozciąganie. Wytrzymałość ta może być zmniejszona na skutek uszkodzenia struktury błony. Komórki, np. krwinki czerwone, umieszczone w roztworze hipotonicznym pobierają wodę i zwiększają swoją objętość. im bardziej hipotomczne jest środowisko komórki, tym więcej pobiera ona wody \ tym bardziej zwiększa się jej objętość. W silnie hipotonicznym środowisku błona komórkowa me wytrzymuje naporu zwiększonej objętości cytopiazmy i pęka.

Oporność osmotyczna to wskaźnik wytrzymałości błony komórkowej na działanie roztworów hipotonicznych. Jej wartość określana jest jako procentowy roztwór NaCl, w którym nastąpiła hemoiiza. Oznacza się 2 wartości graniczne stężenia NaCl: wartość, przy której pierwsze krwinki ulegają hemoWzie (minimum oporności), i wartość, przy której wszystkie krwinki zostały zhemoiizowane (maksimum oporności).

Uszkodzenie błony komórkowej może być skutkiem starzenia się erytrocytów, nieprawidłowej budowy błony (zaburzenia ©rytropoezy) lub działania czynników uszkadzających (chemicznych, immunologicznych).

Na oporność osmotyczną erytrocytów mogą wpływać także procedury analityczne temperatura, czas przechowywania krwi, stosowane antykoagułan-ty. Oporność osmotyczna erytrocytów różnych kręgowców jest różna.

Wykonanie oznaczenia:

1    Przygotuj 1% NaCl (10 g NaCl ♦ 1 dm³ buforu fosforanowego, pH 7,4),

2    W 12 probówkach przygotuj po 2 cm³ roztworów od 0,7% do 0,1% (0,1 0,6; 0.55:0.5; 0.45; 0.4; 0.35.0,3*. 0,25; 0,2; 0,15; 0,1) - według tabeW5.

3    Do każdej probówki dodaj 20 mm³ krwi.

4    Wymieszaj delikatnie wstrząsając.

5. łnkubuj 30 min w temperaturze pokojowej.

6 Odwauj 5 min przy 2000 obr Jmin.

7. Z każdej probówki zbierz delikatnie pipetą 1 cm³ supematantu (uważaj me poruszyć osadu) do nowych probówek, dodaj do każdej 1 cm³ H^O des 8 Zmierz ekstynkcję przy 540 nm wobec ślepej próby (0,7% NaC\y

Oblicz % hemolizy wg wzoru: (E_nx 100) / E100. gdzie:

9.

En - ekstynkcja badanej próby.

E100 - ekstynkcja próby ze 100% hemolizą.

10.    Na rys. 8 wykreśl krzywą dla erytrocytów ryby (X - stężenie NaCl, Y - % hemolizy).

11.    Porównaj oporność osmotyczną erytrocytów ryby i człowieka. Porównaj oporność osmotyczną erytrocytów ryby we krwi pobranej na różne antyko-agulanty (heparyna i 10% Na₂EDTA).

Tabela 5. Oznaczanie oporności osmotycznej erytrocytów ryby we krwi pobranej na różne antykoagulanty

% Nad	cm^3 H20	cm^31% NaCl	heparyna		10% Na2EDTA
			ekstynkcja	% hemolizy	ekstynkcja	% hemolizy
0,70	0,6	1,4
0,60	0,8	1,2
0,55	0,9	1,1
0,50	1,0	1,0
0,45	1,1	0,9
0,40	1,2	0,8
0,35	1,3	0,7
0,30	1,4	0,6
0,25	1.5	0,5
0,20	1.6	0,4
0,15	1.7	0,3
0,10	1.8	0,2

Rys. 8. Porównanie oporności osmotycznej erytrocytów człowieka i ryby we krwi heparynowanej I Z Na*EDTA (na rysunku krzywa dla erytrocytów człowieka)

37