43 (8)

fluoryzujące, a następnie preparat ogląda sic w mikroskopie fluorescencyjnym. Zasadnicze schematy reakcji przedstawiają ryciny 4 i 5.

W metodzie bezpośredniej reakcja zachodzi między znakowanym (fluorochromem) przeciwciałem a antygenem. W metodzie pośredniej w pierwszej fazie używa się przeciwciał nie znakowanych, a po ich związaniu wykazuje się je za pomocą znakowanych przeciwciał anty-giobulinowych. Powstające kompleksy wykazuje się w mikroskopie fluorescencyjnym jako charakterystyczne świecące skupienia.

Dane dotyczące strony mctodyczno-technicznej przygotowania komponentów reakcji i wykonywania samego odczynu, łącznic z kontrolami, zaczerpnięto głównie z pracy Spendlove’a.

Uzyskanie tą metodą szybkiego i miarodajnego wyniku wymaga właściwego pobrania materiału. Śluz i ropę przylegającą do komórek należy,

0    ile to możliwe, usunąć przez¹ płukanie, gdyż powodują nieswoistą fluorescencje. Zeskrobmy ze skórnych zmian pęcherzykowych powinno się pobierać z obwodu dna pęcherzyka po zerwaniu jego wierzchołka. Strupy i krosty powodują nieswoiste świecenie.

Materiał z ośrodkowego układu nerwowego pobiera się metodą biopsji zajętych części mózgu (np. przy herpeswirusowym zapaleniu mózgu u ludzi). Leukocyty z płynu mózgowo-rdzeniowego dają nieswoistą fluorescencję i dlatego są mało przydatne do odczynu.

Komórki rogówki lub spojówki w postaci zeskrobin przenosi się od razu na szkiełka podstawowe. Do diagnostyki wścieklizny zaleca się sporządzanie preparatów odciskowych — powinny zawierać 700 -800 komórek.

Przy wirurii (wirus w moczu) komórki otrzymane przez wirowanie świeżego moczu przepłukuje się przez zawieszanie w buforowanym płynie fizjologicznym; liczba komórek jest zwykle mała i wystarcza na sporządzenie niewielu rozmazów.

Zalety odczynu immunofluorcsccncji to: możność wykrycia antygenu wirusowego, gdy jest on jeszcze w komórce, wystarcza do tego niewielka liczba komórek oraz trwałość preparatów po utrwaleniu. Wady odczynu to: konieczność posiadania nie zawsze łatwych do nabycia dobrych swoistych surowic i koniugatów, wysoki koszt dobrego mikroskopu fluorescencyjnego, konieczność posiadania dużej wprawy u osoby badającej z uwagi na nieswoiste reakcje niektórych materiałów.

Obecnie coraz więcej producentów, nie tylko zagranicznych ale

1    krajowych, oferuje komponenty do odczynu IF. Dlatego zbędne jest

_0vU(Ago± -    ^

I

ł\.

podawanie szczegółów sporządzania głównego komponentu odczynu, jakim jest koniugat. Tak nazywa sie kompleks odpowiedniego barwnika fluoryzującego (fluorochromu) ze swoistym dla danego wirusa (lub innego antygenu) przeciwciałem. W odczynie pośrednim koniugatem jest kompleks fluorochromu z przeciwciałem dla globulin tego gatunku zwierzęcia, którego przeciwciała użyto w pierwszej fazie reakcji. Dążeniem pracowni rozpoznawczych powinno być maksymalne ujednolicenie odczynów, a uzyskać to można przez używanie standaryzowanych preparatów diagnostycznych, co oczywiście jest łatwiejsze przy użyciu koniugatów zrobionych w odpowiednich zakładach produkcyjnych, niż przy sporządzaniu tych odczynników przez poszczególne laboratoria oddzielnie. Sporo dobrych koniugatów do odczynu IF w zakażeniach wirusowych poleca „Gamako”, Nitra w Czechosłowacji.

Cykl sporządzania koniugatów obejmuje, w najogólniejszym zarysie, otrzymanie surowic przez uodpornienie zwierząt oczyszczonym wirusem, wytrącenie i oddzielenie (oczyszczenie) gammaglobulin oraz znakowanie ich odpowiednim fluorochromem. Najczęściej są używane izotioc\janmn Pumesceiny i rpdamina

Przygotowanie preparatów do badania w odczynie IF zależy od rodzaju materiału zakaźnego. Będą tu omówione sposoby wykazywania wirusa bezpośrednio w nadesłanym materiale pobranym od zakażonego zwierzęcia.

Sporządzanie i barwienie preparatów. 1. Rozmazy zakażonej tkanki sporządzać można przez wykonanie preparatów odciskowych z powierzchni przeciętych tkanek, powierzchni błon śluzowych i innych, a także przez roztarcie małej ilości materiału między szkiełkami przedmiotowymi. Preparat stanowić też może wysięk. Preparaty należy wysuszyć na powietrzu. Skrawki histologiczne tkanki badanej najlepiej poddać suszeniu nawiewnemu przez jedną godzinę w temperaturze 0 2' C.

2. Utrwalanie wykonuje się najczęściej acetonem o temperaturze 4°C, przez 5    10 minut. Zarówno temperatura? jalT i czas mogą ulegać

zmianom w zależności od rodzaju wirusa.

Dalsze postępowanie różni się w zależności od metody IF. Przy metodzie bezpośredniej (a):

3a. Nanosi się na preparat koniugat i barwi przez odpowiedni czas i w odpowiedniej temperaturze — oba te czynniki powinny być ustalone doświadczalnie. Zwykle barwienie wykonuje się przez 20—60 minut w temperaturze 37°C w komorze wilgotnej, chociaż niektórzy uważają za lepsze barwienie w 4°C przez dłuższy czas.

43