97

FMN, który utleniany jest w wyniku przeniesienia elektronów na drugą grupę prostetyczną, tj. protohem. Elektrony z protohemu mogą być przekazywane na cytochrom c lub inne akceptory.

Enzym ten katalizuje utlenianie L(+) mleczanu do pirogronianu w obecności odpowiedniego akceptora elektronów, np. cytochromu c (akceptor naturalny) lub sztucznych akceptorów, takich jak żelazicyjanek czy błękit metylenowy. W warunkach fizjologicznych ostatecznym akceptorem elektronów jest tlen.

Dehydrogenaza mleczanowa utlenia mleczan według reakcji:

CH₃ • CHOH- COO" + enzym -FMN —> CH₃ • CO • COO" + enzym-FMNH₂

Zredukowany FMN regenerowany jest w wyniku przeniesienia elektronów na protohem i przez układ cytochromowy na tlen cząsteczkowy'.

Natomiast przy zastosowaniu sztucznego akceptora elektronów, np. żelazicyjanku potasowego, reakcja przebiega według równania:

CHj - CHOH - COO" .    JSS&

CH₃ • CO • COO' + 2[Fe(CN)₆]⁴" + 2H+

W warunkach tlenowych reakcja ta jest nieodwracalna.

Optimum pH dla działania dehydrogenazy L(+) mleczanowej drożdżowej zależy od rodzaju akceptora elektronów, np. dla żelazicyjanku wynosi 8,0, dla cytochromu c — 7,0, a dla błękitu metylenowego — 6,8.

Zasada stosowanej metody. W opisanej metodzie miarą aktywności dehydrogenazy' L(+) mleczanowej drożdżowej jest ilość żelazicyjanku potasowego zredukowanego w określonym czasie i optymalnych warunkach działania, tj. przy odpowiednim stężeniu substratu, pH 8,0 i temperaturze 37°C.

Po przerwaniu reakcji enzymatycznej oznacza się nadmiar żelazicyjanku w próbie pełnej oraz całą ilość dodanego żelazicyjanku w próbie kontrolnej. Próba kontrolna uwzględnia również poprawkę na redukcyjność odczynników i wyciągu enzymowego. Stosow'ana metoda oksydymetryczna oznaczania żelazicyjanku polega na utlenianiu przez ten związek w środowisku kwaśnym jonu jodkowego do wolnego jodu zgodnie z reakcją:

2[Fe(CN)₆]^3- + 2T —+ h

Aby przesunąć równowagę reakcji i umożliwić przebieg jej do końca, powstający żelazocyjanek usuwany jest z roztworu za pomocą siarczanu cynkowego.

W tych warunkach ilość wydzielonego I₂ jest równoważna nadmiarowi żelazicyjanku. Wydzielony jod odmiareczkowuje się mianowanym roztworem tiosiarczanu sodow'ego zgodnie z reakcją:

I₂ + 2S₂0₃^2--^ 2T + S₄0₆²"

86