CCF20100311 001
Rybonukleazy dzielą się na trzy podpodklasy 1/ Endorybonukleazy EC 3.1.26 2/ Egzorybonukleazy EC 3.1.13 i 3/ Restryktazy.
Przedmiotem ćwiczeń będzie rybonukleaza z trzustki świni - RNaza I. Enzym ten jest endorybonukleazą i hydrolizuje wiązania fosfodiestrowe znajdujące się za nukleotydarni prymidynowymi. RNazy zwierzęce charakteryzują się zróżnicowanym optimum pEL Najlepiej poznanym enzymem jest rybonukleaza trzustki bydlęcej RNaza I. Jest to enzym o masie cząsteczkowej 12 700 Da, zbudowana z 124 aminokwasów tworzących pojedynczy łańcuch peptydowy. Enzym zawiera cztery mostki disiarczkowe. Ta duża ilość mostków dwusiarczkowych i mała masa cząsteczkowa decydują o termostabilności enzymu. Rybonukleaza traci jedynie 20% aktywności po ogrzaniu przez 30 min w temp 100°C w pH 2-5. Enzym jest aktywowany przez NaCl, NaNC>2, Na2S04, KC1, KBr, NH4CI i hamowany przez p-chlorortęciobenzoesan, detergenty anionowe, kwas hialuronowy heparynę, pektyny, amylozę.
Izolowanie i oznaczanie aktywności z trzustki wieprzowej/bydlęcej.
I. Izolacja
Materiał: Trzustka wołowa lub wieprzowa
Odczynniki: 120 mM roztwór H2SO4
(NELO2SO4 in substantia wysuszony w temp 80°C i roztarty na pył.
Wykonanie
Izolacja RNazy z trzustki
1. 2,5 gram tkanki rozdrabniamy skalpelem i homogenizujemy w 50 ml 120 mM H2SO4 w homogenizatorze.
2. Uzyskany homogenat mieszamy na mieszadle magnetycznym 30 min.
3. Zawiesinę wirujemy przez 15 min, 25 000 x g. Supematant zlewamy i pozostawiamy do dalszych etapów.
4. Osad zawieszamy w 25 ml 120 mM H2SO4 mieszamy na mieszadle magnetycznym 30 min i wirujemy 10 min, 25 000 x g. Supematant pozostawiamy, a osad odrzucamy.
5- Oba supematanty (z etapu 3 i 4) łączymy i dodajemy porcjami siarczanu amonu do 40% nasycenia (264 g (NELO2SO4/I). Zawiesinę wirujemy (15 min, 25 000 x g).
6. Osad odrzucamy. W uzyskanym supematancie podnosimy stężenie (NH4)2S04 do 80% nasycenia (285 g na litr) i umieszczamy w lodówce na 12 - 14 godz.
7. Próby wimjemy przy 25 000 x g przez 15 minut. Osad zawierający surową frakcję RNazyl rozpuszczamy w Eł20 (lg osadu na 5ml E^O).
Oznaczanie aktywności.
Odczynniki: 2% roztwór RNA w H20
Bufory: a. 50 mM bufor fosforanowy pH 7.0; b. 50 mM bufor octanowy pH 4.0. 2MHC1
2
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Rybonukleazy dzielą się na trzy podpodklasy 1/ Endorybonukleazy EC 3.1.26 2/ Egzorybonukleazy EC 3.1
Laboratorium Elektroniki cz I 6 128 Parametry techniczne transoptora dzielą się na trzy grupy: par
Krzywa wannowa. to krzywa życia obiektu dzieląca się na trzy etapy: 1. liczne
58562 Laboratorium Elektroniki cz I 6 128 Parametry techniczne transoptora dzielą się na trzy grup
- 26 lipiec 1826 - Bohdan Zaleski otrzymuje pocztą program Rocznika, dzielący się
Laboratorium Elektroniki cz I 6 129 128 Parametry techniczne transoptora dzielą się na trzy grupy:
Laboratorium Elektroniki cz I 6 128 Parametry techniczne transoptora dzielą się na trzy grupy: par
IMAG1949 4. Przemysłowe Dzielą się na trzy grupy: -oleiste, -włókniste,
PAGE105 SK^TlSHY OPERACYJNĄ Funkcje systemu operacyjnego Funkcje użytkowe dzielą się na trzy grupy:
23159 PA210634 Podwzgórze Jest częścią międzymózgowia. Jego jądra dzielą się na trzy grupy: >
Tytuły egzekucyjne dzielą się na trzy grupy. 1) Orzeczenia sądowe i niektórych inn
Włókna nerwowe Włókna nerwowe dzielą się na trzy podstawowe grupy: A.
Koper wioski 241 2. subspeeies capillaceum Holmrn. dzielący się na trzy odmiany: a)
więcej podobnych podstron