CIMG4149

kompleksów (np. elektroforetycznie lub immunoprecypitacyjaie) pozwala na odczyt diagnostyczny.

Wiele bardziej przydatnych technik opracowano do praktyki medycznej, w tym do diagnostyki wirusologicznych zakażeń i zachorowań, a zwłaszcza oparte na stałych podłożach (solid phase RI A), przydatne do wykrywani^ antygenów i przeciwciał.

Stosując głównie ^12SI opracowano zestawy diagnostyczne oraz zbadano ich przydatność dla szerokiego zakresu zakażeń wirusowych (wykrywanie wirusów i(lub) swoistych przeciwciał) metodami radioimmunologicznymi: wirusowe zapalenie wątroby B, rotawirusy, adenowirusy, herpeswirusy, wirus RS, para-influenzy, różyczki, wirusy grypy, arbowirusy, retrowirusy. Nie ma wątpliwości, że opracowane metody radioimmunologiczne są bardzo czułe i swoiste, dają odtwarzalne wyniki. Ich powszechniejsze stosowanie jest jednak uwarunkowane posiadaniem sprzętu, pozwalającego na odczytanie próbek radioaktywnych oraz ochronę środowiska.

METODY IMMUNOENZYMATYCZNE

Metody immunoenzymatyczne w najszerszym zakresie weszły zarówno do diagnostyki zakażeń wirusowych, jak i innych zakażeń, a także do medycznej praktyki laboratoryjnej. Pierwsze prace opisujące metodę, tzw. enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA), czyli metodę immunoenzymatyczną, pojawiły się w 1971 r. Założenia są analogiczne jak w technikach immunofluorescencyj-nych i radioimmunologicznych. I w tej technice na unieruchomionym, związanym z podłożem antygenie lub przeciwciele (znakowanym enzymem) wiąże się odpowiednik zawarty w badanej surowicy (odpowiednio przeciwciało lub antygen), a powstanie kompleksu antygen-przeciwciało ujawnia się przez zmianę koloru detektora (w IF przez świecenie fluorescencyjne, w RIA przez promieniowanie radioaktywne).

Metoda ELISA, wykorzystując wszystkie podstawowe założenia i możliwości diagnostyczne RIA i IF, nie jest obciążona takimi zagrożeniami zdrowotnymi, jak promieniowanie i skażenie środowiska, jest technicznie prostym odczynem, a ekonomicznie jest bez wątpienia metodą tanią. Wykonanie wymaga jedynie staranności, poza tym jest proste i nieskomplikowane (rozcieńczenie, inkubacja, odmywanie, odczyt). Odczytywanie wizualne może być bezpośrednie lub za pomocą kolorymetru, lub spektrofotometru (odczyt spektrofotometrycz-ny daje większą dokładność w ocenie prób, które odczytywane są wizualnie jako prawdopodobnie dodatnie „+”), przy użyciu sprzętu elektronicznego z automatycznym zapisem. Stosowane we współczesnych zestawach diagnostycznych odczynniki są bezpieczne w użyciu.

Metodami ELISA można wykrywać zarówno obecność antygenów i przeciwciał wirusowych, jak i określać ich zawartość ilościową, a więc ustalać miano w danej jednostce objętości. Można także wykrywać aktywność w określonych klasach immunoglobulin, a także określić obecność dla poszczególnych jednostek strukturalnych wirusów. Zestawy diagnostyczne są produkowane przez liczne firmy i są powszechnie znane. Teoretycznie wykorzystywanie tych metod może dotyczyć wszystkich zakażeń wirusowych, a szerokie zastosowanie znalazły w odniesieniu do wszystkich najważniejszych zakażą wirusowych.

Zalety metod immunoenzymatycznych są oczywiste. Szybki wynik, bezpieczeństwo wykonania, prostota odczytu i interpretacji, możliwość pełnej automatyzacji. Najczęściej stosowane warianty metodyczne przydatne do diagnostyki wirusologicznej zestawiono w tab. 18 i 19.

METODA PEROKSYDAZOWA

Odpowiednie przeciwciała skierowane przeciwko poszukiwanemu antygenowi wiąże się kowalentnie z per oksydazą, co nie pociąga za sobą zaburzeń w aktywności przeciwciał ani w aktywności enzymatycznej per oksydazy.

Początkowo stosowano kwaśną fosfatazę do znakowania przeciwciał, którą następnie zastąpiono bardziej stabilną peroksydazą chrzanową. Dochodzi do reakcji między antygenem i znakowanym przeciwciałem, co ujawnia się przez ekspozycję barwionych komórek (tkanki) na łatwo przenikający roztwór (DAB) i wodę utlenioną. Związany enzym najpierw redukuje nadtlenek wodoru do wody, a następnie utlenia DAB. Utleniony DAB polimeryzuje do postaci nie dyfundującej, nierozpuszczalnej, wytrącającej się na cząsteczkach antygenu. Odczytuje się optycznie bezpośrednio. Jest to metoda prosta, niesie jednak możliwość błędnych oznaczeń, gdyż niektóre tkanki zwierzęce mają endogenną peroksydazę, dając nieswoiste barwienie. Można temu zapobiec, działając uprzednio inaktywatorami endogennej peroksydazy. Jednak takie działanie może uszkodzić niektóre antygeny. Te trudności ograniczyły stosowanie metody w diagnostyce wirusologicznej, mimo późniejszego opracowania kilku jej modyfikacji metodycznych, które zwiększyły jej czułość. Za pomocą tych metod można wykryć wirusy należące do różnych grup taksonomicznych, min. myk-sowirusy i herpeswirusy.

METODA NEUTRALIZACJI

Metodą, w której uzyskuje się duży zasób informacji, zwłaszcza istotnych dla rozeznania stanu odporności organizmu, jest odczyn zobojętnienia. W odczynie tym wykrywamy przeciwciała znoszące zakaźność wirusów. Odczyn można wykonać w zależności od wirusa w hodowlach komórkowych in vitra łub in vivo na zarodkach kurzych i wrażliwych zwierzętach doświadczalnych.

Wartość miana przeciwciał zobojętniających można określić bądź przez zbadanie tego rozcieńczenia surowicy, w którym jeszcze dochodzi do zobojętnienia określonej dawki zakaźnej wirusa wyrażonej w TC1D_S0 lub PFU, bądź działając nie rozcieńczoną surowicą na różne stężenia preparatu wirusowego. Pierwsza metoda jest częściej stosowana do rutynowych badań diagnostycznych. Technicznie przebiega w następujący sposób: różne rozcieńczenia surowicy, lecz o identycznych objętościach, miesza się z jednakową dawką aktywnego wirusa (też w jednakowej objętości). Mieszaninę po okresie wstępnej inkubacji (dla wcześniejszego połączenia wirusa z przeciwciałami), lub bez, wprowadza się do wrażliwych na danego wirusa hodowli komórkowych, zarodków kurzych lub wrażliwych zwierząt. To rozcieńczenie surowicy, które zobojętni patogenne właściwości wirusa dla użytego systemu biologicznego, oznacza miano przeciwciał zobojętniających.

163