CIMG4147

Zastosowanie mikroskopu świetlnego

Mikroskop świetlny pozwala na obserwację licznych zmian charakterystycznych dla wirusa zakażającego komórki. Rozmaz materiału badanego na szkiełku podstawowym (np. z błon śluzowych, z rogówki, ze zmian skórnych, z narządów) albo preparat odbitkowy utrwala się alkoholem, a następnie odpowiednio barwi (np. metodą Giemzy, hematoksyliną i eozyną).

Metoda ta może być zastosowana do diagnostyki zakażeń wirusami herpes i cytomegalii, pokświrusami, wirusem wścieklizny. Uzupełniona metodą nnmu-nofłuorescencji pozwala na szybkie rozpoznanie licznych zakażeń wirusowych. Zastosowanie w diagnostyce wścieklizny pozwala na wykrycie ciałek Negriego u zwierzęcia zarówno naturalnie, jak i diagnostycznie zakażonego. Wykazanie wtrętów wewnątrzjądrowych w przypadku wirusów herpes i cytomegalii albo cytopłazmatycznych w przypadku pokswirusów, wirusów parainfluenzy i orto-myksowirusów może mieć znaczenie pomocnicze.

" Metoda mikroskopowa jest poza tym podstawową drogą obserwowania wszelkich innych zmian cytopatycznych, jak zmiany degeneracyjne, powstawanie komórek wiełojądrzastych (herpes, odra) w hodowlach komórek m ritro i w wycinkach z narządów (wątroba, mózg, skóra, mięśnie) zaatakowanych przez wirusy. Uzyskujemy wgląd w zmiany patologiczne dotyczące różnych składników strukturalnych zakażonych komórek.

Mikroskopia elektronowa

Mikroskop elektronowy stworzył nową erę możliwości diagnostycznych. Pod tym względem jego rola, oprócz zalet poznawczych, dotyczących budowy wirionow, jest szczególnie istotna w badaniu tych zakażeń, w których również element czasu jest szczególnie istotny (szybka diagnostyka).

Oprócz tego mikroskopia elektronowa otwiera możliwości badania udziału wirusów w onkogenezie. w zakażeniach utajonych i przewlekłych. Możliwe jest badanie aic tylko wydzielin tub treści z materiałów powierzchniowych, ale również wewnątrzkomórkowego umiejscowienia wirusów (ultracienkie skrawki). Na powszechniejsze stosowanie mikroskopu elektronowej rzutuje jednak stałe jeszcze duża rena mikroskopu oraz wysoki koszt jego eksploatacji. Dlatego stosowany jest on głównie do badań poznawczych oraz w szczególnie groźnych sytuacjach epidemicznych (w przeszłości głównie w diagnostyce ospy, następnie gorączek krwotocznych — Ebola, Lassa, Marburg).

Mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do uwidocznienia kompleksów antygen-przedwdało (mikroskopia hmnunoelcktronowa), a tym samym stwarza możliwość bezpośredniego typowania serologicznego wirusów.

A zatem mikroskopia elektronowa polega na wykazaniu obecnośd i identyfikacji wirusa z wykorzystaniem jego cech morfologicznych, a w wariancie immuno-elektionowo-mikroskopowym na identyfikowaniu opartym na cechach anty genowych wirusa. Należy jednak podkreślić, że różnicowanie wirusów w tej metodzie, na podstawie ich morfologii, jest możliwe tylko w przypadku nielicznych wirusów. Można np. odróżnić pokswirusy od herpeswirusów, ale np. w obrębie pikornawirusów różnicowanie na podstawie obrazu morfologicznego jest praktycznie niemożliwe. Dopiero wprowadzenie barwienia negatywnego umożliwiało większy wgląd w budowę anfżri; rpr-hnit-a cieniowania.

Spośród próbek pochodzących od chorych na pfryJną uwagę, pod względem przydatności do badania w mikroskopie elektronowym, następujące:

1)    treść pęcherzyków i wysypkowych zmian na skórze i(lub) Monach śluzowych, a badana na obecność pokswirusów, herpeswirusów;

2)    wydzieliny z dróg oddechowych gównie w kierunku paramyksowirusów;

3)    płyn mózgowo-rdzeniowy w kierunku herpeswirusów i wirusa nagminnego zapalenia ślinianek przyusznych (encephalitis);

4)    kał w kierunku rotawirusów, hepatitis A. parwowirusów,

5)    mocz w kierunku wirusa cytomegalii (barwienie negatywne) oraz parwo wirusów i wirusa połyoma;

6)    krew i wycinki do wykrywania wirusa wirusowego zapalenia wątroby B (wątroba), wirusów HTV (węzły chłonne), wirusów Herpes simplex i odry (mózg).

Mikroskopia elektronowa, wykorzystując swoiste przeciwciała, pozwala też na bezpośredni wgląd w kinetykę tworzenia i następstwa powstania i działania kompleksów wirus—przeciwciakł.

Istnieje też możliwość użycia metody mikroskopii elektronowej do wykrywania przeciwciał. Próby takie wymagają zastosowania ściśle zdefiniowanego wirusa, który dodany do badanej surowicy chorego tub ozdrowieńca (warunkiem powodzenia jest obecność przeciwciał) pozwala na ujawnienie natury przeciwciał otaczających cząstki wirusowe, co przy różnych stężeniach może dać pomiar ilościowy. Czułość i wyrazistość reakcji można np. zwiększyć, stosując barwienie białkiem A, znakowanym złotem.

Badanie mikroskopowo-ełektronowe może być zastosowane również do badania komórek, ich skrawków, komórek w różnych stadiach zakażenia wirusowego i zmian morfologicznych komórek, a także losów wirusów w komórkach immunologicznie czynnych, np. w komórkach fagocytarnych. A wiec przydatne jest do badania procesów patologii i patologu molekularnej. Są to już raczej zastosowania poznawcze nie stosowane w diagnostyce wirusologicznej.

Mikroskopia immunofluorescencyjna

Opracowanie metod mikroskopii immunofluorescencyjnej bardzo znacznie przyczyniło się do rozwoju niezmiernie ważnej dziedziny - szybkiej diagnostyki wirusologicznej.

Znalazły one m.in. powszechne zastosowanie w diagnostyce zakażeń wirusem wścieklizny, służą do identyfikacji przeciwciał należących do określonej klasy imm unoglo bulin i o określonej aktywności przedwwirusowej (np. IgM. IgG - zakażenia wirusami różyczki, cytomegalii, Epsteina-Barr). Metody te wprowadzono i doskonale zdają egzamin w bezpośrednich badaniach materiałów diagnostycznych pobranych od chorych. Stosując bądź metodę bezpośrednią (znakowana odpornościowa surowica dla danego wirusa), bądź metodę pośrednią (znakowana surowica antyglobulinowa i odpowiednia swoista surowica odpornościowa dla danego typu wirusa) można wy kazać obecność anty-

159