DSC00844

Kanały i ich przewodnictwo

Pompy, receptory i kanały są tymi kompleksami białek błonowych, których funkcje fizjologiczną można badać tylko w układzie dwupizedziałowym rozdzielonym błoną biologiczną a więc umożliwiającym funkcję wektorialną. Kolejne etapy badawcze, to izolacja peptydów i oligomerów w detergentach, ich oczyszczanie (np. via wiązanie do toksyn związanych z podłożem), rekonstrukcyjne wbudowanie w blonki fosfolipidowe (Mońki płaskie lub liposomy) i analiza parametrów funkcji tak rekonstruowanego układu.

W przypadku kanału możliwe jest, dzięki odpowiedniemu rozcieńczeniu wbudowanych białek, ograniczenie pola pomiarowego charakteryzującego przepływ jonów do pojedynczego kanału. Jednak działanie kanału w układzie zrekonstruowanym może przebiegać inaczej niż w komórce. Stąd ogromne znaczenie i powszechność stosowania ostatnio — w różnych wariantach — metody mierzenia przepływu jonów przez pojedyncze kanały w natywnej Monie różnych typów komórek, a nie tylko aksonu mątwy, tradycyjnego modelu neurofizjologicznego. Opracowanie w r. 1976 i sprawdzenie w następnych latach użyteczności tej metody, zwanej „patch-clam-ping", w badaniu kanałów w neuronach i komórkach postsynaptycznych przyniosło jej autorom (E. Neher i B. Sackman) uznanie w postaci Nagrody Nobla w 1991 r. Zasadę metody ilustruje rysunek 32.4.

Mała latka Mony (patch) zostaje szczelnie przyssana do wylotu mikropipetki (elektrody) o średnicy ok. 0.5 pm wypełnionej elektrolitem. W optymalnym przypadku (przy odpowiednio małym zagęszczeniu kanałów w Monie) w świetle łatki znajduje się tylko jeden kanał. W nietkniętej komórce elektroda referencyjna jest wkłuta do cytoplazmy. W łatkach oderwanych większym podciśnieniem od komórki elektrodą referencyjną jest doświadczalny płyn zewnętrzny. Włączony w obwód elektryczny układ stabilizujący (clamping) potencjał obu elektrod na dowolnym poziomie. pozwala na pomiar przewodnictwa jonowego przez badany kanał jako funkcji różnego potencjału po obu stronach Mony.

Wielkość prądu niesionego przez przepływ danego jonu przez Monę zależy zarówno od omówionej wyżej siły napędowej, jak i od łatwości, zjakąjon przenika przez dany układ Monowy. Ta ostatnia wartość, określana jako przewodnictwo kanału, gj jest mierzona w Siemensach, S (S = 1/ohm = Amp/V). Prąd przepływający przez kanał ma więc wartość gj (Vm —'Vj), np. dla kanału K* ma on wartość gtc" (Vm - Vą*). Przewodnictwo pojedynczego kanału mieści się zazwyczaj w zakresie 1-100 pS i zależy od stopnia otwarcia kanału (tzw. podstany funkcjonalne), modulowanego przez różne czynniki, w tym przez AY.

Przy spoczynkowym potencjale Mono wy m, w większości komórek głównym kanałem otwartym jest typ kanału potasowego zwany przeciekowym (K* leak channel) i dlatego gx dominuje w całkowitym przewodnictwie Mony. Jednak przy prądzie czynnościowym i powstawaniu pobudzającego potencjału postsynaptycznego w komórkach nerwowych i mięśniowych otwiera się, choć na krótko, duża ilość kanałów Na* i wtedy w całkowitym przewodnictwie błony dominuje gN«*. Przewodnictwo to jest proporcjonalne do ilości kanałów Na*, otwartych w danym momencie. Przewodnictwo pojedynczego kanału Na* w aksonie mątwy (75 kanalów/pm² Mony) wynosi -4 pS. Podobny jest rząd wielkości przewodnictwa kanałów Monowych w synapsie (rys. 32.43).

W szczycie prądu czynnościowego w aksonie mątwy przewodnictwo błony wynosi: gN»* = 300 pS/pm², a odpowiedni prąd Na*. W = 5 pA/jim². Jeśli trwa on 0.2 ms. powoduje przeniesienie poprzez MonęO.OOl pc/pm² (pc = 10~¹² Kulomba. C) przy typowej pojemności (w Faradach. F) Mony komórkowej 1 pF/cm² = 0,01 pF/pm². Przeniesienie tej ilości ładunku zmieni potencjał Mony o 100 mV (z definicji IC dający IV = 1F).

574