DSC
12 (13)

170    8. Biotyna

CM

II

HOOC—CH

-COOH CfiHsCHgNHz .

COCL

c_eH I₅Mz%

o

II

dkl

_/,CH2C₆H_s

N N \ / HC—CH

HOOC COOH

^00)0

Saęop_H

C_eH_t1OH

o

CHjCSK

DMF

JL

H-)-(-H

CobH

o—c

II

o

I^SO,,

D-biotyna

Rys 8.6 Schemat syntezy D-biotyny

dibromobursztynowego) i benzyloaminą tworzy mezo-formę kwasu 1,2-diben-_zyloaminobursztynowego. Pod działaniem fosgenu następuje cyklizacja z wytworzeniem kwasu l,3-dibenzylo-<»-imidazolino-c(s-4,5-dikarboksylowego. iCwas ten z łatwością tworzy odpowiedni bezwodnik, który pod wpływem cykloheksanolu daje monoester w postaci racematu.

Racemat ten jest rozdzielany na enancjomery za pomocą odpowiedniej optycznie czynnej zasady organicznej, np. efedryny. Właściwy enancjomer jest ponownie poddawany cyklizacji z wytworzeniem bezwodnika. Redukcja estru pod działaniem tetrahydroboranu litu LiBH₄ jest ściśle ukierunkowana, albowiem ulega jej wyłącznie grupa estrowa. W ten sposób powstaje lakton o pożądanej konfiguracji. Wbudowanie siarki zachodzi w wyniku działania na ten lakton tiooctanu potasu CH₃COSK, w efekcie czego tworzy się tiolakton.

Łańcuch boczny jest przyłączany w dwuetapowym procesie. W pierwszym etapie przeprowadza się reakcję Grignarda, w której następuje przyłączenie trójwęglowego łańcucha. Uwodornienie katalityczne otrzymanego związku w obecności Ni Raneya i następująca po tym dehydratacja prowadzi do powstania nowego centrum chiralnego oraz do utworzenia dodatkowego pięcioczłonowego pierścienia i związku o charakterze sulfo-niowego kationu. Pod działaniem soli sodowej dimetylomalonianu następuje przyłączenie dwóch dodatkowych atomów węgla i wydłużenie łańcucha bocznego do pożądanej wielkości. Hydroliza grup estrowych z następującą po tym dekarboksylacją i odszczepieniem dwóch reszt benzylowych zachodzi pod wpływem HBr w podwyższonej temperaturze. W rezultacie otrzymuje się czystą, optycznie czynną D-biotynę z wydajnością ponad 25%.

Opisana metoda wysoce stereospecyficznej syntezy jest szczególnie przydatna do celów praktycznych, albowiem w jej wyniku nie tworzą się inne izomery biotyny — epibiotyna, allobiotyna i epiallobiotyna.

8.6. Metody oznaczania

Wśród rozlicznych metod oznaczania biotyny na plan pierwszy wysuwają się testy mikrobiologiczne. Zazwyczaj stosowane są następujące mikroorganizmy: Lactobacillus casei i Lactobacillus plantarum, Neurospora crassa, Ochromonas donica oraz Saccharomyces cerevisiae. Jednakże niektóre analogi czy też izomery biotyny, tak samo jak związane z białkiem formy tej witaminy, nie stymulują wzrostu mikroorganizmów. Z tego względu związana z białkiem biotyna musi być najpierw uwolniona w wyniku kwasowej hydrolizy lub trawienia papainą. Zawartość biotyny w badanym materiale określa się na podstawie porównania wzrostu odpowiedniego mikroorganizmu z próbą standardową o znanym stężeniu biotyny.