DSC
23 (12)

192    9. Cyjanokobalamina

Niezmiernie istotnym zagadnieniem w mikrobiologicznej syntezie witaminy B11 jest wzbogacanie podłoża hodowlanego w kobalt i 5,6-dimetylobenzi-midazol. aczkolwiek wiadomo, że niektóre mikroorganizmy mają zdolność syntetyzowania 5,6-dimetylobenzimidazolu.

Do otrzymywania czystych (farmakopealnych) preparatów witaminy B_I2 szeroko wykorzystuje się bakterie propionowe: Prop ionibac ter i um sh er manii i Propionibacterium freudenreichii.

W tym przypadku proces- mikrobiologicznej syntezy witaminy B₁₂ może być prowadzony systemem fermentacji dwustopniowej. W pierwszej fazie, tzw. beztlenowej (anaerobowej), trwającej ok. 72 godzin wytwarzany jest kobinoamid, natomiast w drugiej, tj. w ciągu 2-3 następnych dni, proces prowadzony jest w obecności tlenu (faza aerobowa) i wówczas wytwarzany jest 5,6-dimetylobenzimidazol, a co za tym idzie również kobalamina, która działa hamująco na syntezę korynoidów. A zatem w przypadku kiedy tlen nie jest dostarczany do środowiska hodowlanego, ani 5,6-dimetylobenzimidazol. ani też (co jest konsekwencją braku tej zasady azotowej) kobalamina nie są wytwarzane i proces syntezy kobinoamidu nie podlega żadnej represji.

W praktyce stosowane są najprzeróżniejsze pożywki zróżnicowane przede wszystkim pod względem źródła węgla.

Bardzo dobrym źródłem węgla dla kobalaminotwórczych szczepów są węglowodany, aczkolwiek pewne drobnoustroje z rodzaju Pseudomonas czy Nocardia mogą wykorzystywać w charakterze źródła węgla również węglowodory. a także produkty ich utleniania, w szczególności metanol. Na podłożu laktozowym (40 g/l). zawierającym ekstrakt drożdżowy (5 g/l) i wodorofosforan diamonowy (0,5 g/l), wzbogaconym w sole kobaltu (5 mg/l) Co(N0₃)₂ i 5,6-DBI (15 mg/l), w obecności 0,05% glutaminianu i 0,5% betainy nagromadzanie witaminy B₁₂ przez P. shermanii dochodziło do 5,4 mg/l.

Spośród wszystkich znanych producentów tej witaminy największą zdolnością kobalaminotwórczą wyróżniają się bakterie propionowe (Propionibac-leriumi które mogą nagromadzać 40 mg i więcej kobalaminy w litrze podłoża.

Inną grupę producentów witaminy B₁₂ stanowią bakterie metanowe, a w szczególności Methanosarcina barkeri, dobrze rozwijające się w obecności metanolu w środowisku. Do celów przemysłowych wykorzystuje się zazwyczaj mieszane i eklektyczne) kultury gnilnych metanogenów. Mogą one nagromadzać w podłożu, zawierającym metanol w ilości 0,5%, nawet ok. 40 mg kobalaminy w litrze.

Metodq termofilnej (50- 55 C) fermentacji metanowej można otrzymywać koncentraty witaminy B,₂ bardzo przydatne do wzbogacania pasz. Są one wielokrotnie tańsze od preparatów uzyskiwanych przy użyciu bakterii propio-nowych, a sam proces fermentacji metanowej jest znacznie prostszy i może byc prowadzony bez szczególnej obawy o zakażenie postronną mikroflorą.

Fermentacji metanowej można poddawać różne odpady przemysłu spożywczego (np. wywar melasowy), rolnictwa czy nawet ścieki komunalne.

Do fermentacji metanowej wykorzystuje się najczęściej mieszane kultury niikroorganizmów. Proces termofilny zachodzi w temperaturze 55 - 57°C, przy pH 8, w warunkach beztlenowych. Prowadzony jest tzw. metodą półciągłą. \V początkowej fazie procesu wymianie podlega 3-5% ogólnej objętości układu fermentacyjnego, a po ustaleniu się równowagi i zoptymalizowaniu warunków wymiana może wynosić nawet 10% na dobę.

W celu zwiększenia ilości tworzącej się witaminy B₁₂ do środowiska fermentującego dodawane są sole kobaltu w ilości 4-5 mg/l oraz metanol lub etanol w ilości nie przekraczającej 1%.

W ustalonych warunkach procesu ilość nagromadzanych kobalamin może dochodzić do 5 mg/l. Wtedy to odebraną porcję odfermentowanej cieczy zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 60 - 70°C do zawartości suchej substancji ok. 35%, zagęszczony koncentrat suszy się w suszarkach rozpryskowych bądź bębnowych. Otrzymany suchy koncentrat zawiera 3-8% wody i jest niezmiernie higroskopijny. Z tego to względu musi być szybko pakowany do hermetycznych opakowań, np. do worków polietylenowych. Preparat ma postać drobnego proszku o brązowym zabarwieniu. Zawiera on do 120 mg kobalamin w 1 g, a ponadto jest bogatym źródłem innych witamin grupy B oraz aminokwasów i betainy.

W hodowli zwierząt gospodarskich stosowane są wzbogacone pasze, zawierające 50- 100 mg witaminy B₁₂ w 1 tonie suchej karmy.

W wyniku fermentacji metanowej różnych odpadów rolno-spożywczych osiąga się trzy zasadnicze efekty:

1)    oczyszczanie ścieków poprzez znaczne zmniejszenie w nich ilości substancji organicznych (BZT₅ obniża się o 90% w porównaniu z wartością wyjściową);

2)    uzyskiwanie tzw. biogazu o wysokiej kaloryczności, zawierającego do 75% metanu;

3)    otrzymywanie koncentratu witaminy B_l2, stanowiącego cenny dodatek do pasz.

Metodą fermentacji metanowej na specjalnych podłożach, wzbogacanych w sole kobaltu, 5,6-dimetylobenzimidazol i metanol, można otrzymać witaminę B,2 w czystej, krystalicznej postaci, która po rekrystalizacji może być wykorzystana do celów leczniczych.

W 1972 r. opublikowano doniesienie o pełnej chemicznej syntezie witaminy B_l2, łącznie z jej formami koenzymatycznymi. Było to jedno z największych, jeśli nie największe przedsięwzięcie w historii w dziedzinie chemii organicznej. Zaproponowana metoda syntezy obejmowała 57 etapów. W późniejszym okresie dzięki udoskonaleniom udało się ją uprościć.