d (284)

1.    Synteza dsDNA pełnej długości odbywa alg przy pomocy:

a)    odwrotnej transkryptazy, DNAzy I, fragmentu Klanowa, Iłgaza (0)

b)    odwrotnej tranakryptazy, RN Azy H, fragmentu Klonowa, llgaza (I)

c)    odwrotnej tranakryptazy, nuklaazy S, fragmentu Klonowa, llgaza (0)

d)    odwrotnej tranakryptazy, hydrolizy alkalicznej, fragmentu Klanowa (0)

2.    Adaptory:

a)    mogą być jednonidowe (1) (ale rzadko, jeżeli mamy do czynienia z lepkim końcami różnego typu wtedy możemy zastosować adaptory jednonidowe. Te adaptory stanowią spinkę - mostek - łączący 2 końce o różnym charakterze)

b)    mogą być dwuniciowe (1) (przeważnie używa się dwunidowych)

c)    mogą wykazywać się niakompłementarnośclą (1)

d)    mogą łączyć lepki koniec 5' z lepkim 3' (albo lepki 3' z lepkim 5') (1)

3.    Fragment Klanowa pollmerazy I E coli:

a)    wykorzystywany w znakowaniu random prłmłng (1) (inaczej metoda przypadkowych starterów)

b) ma aktywność egzonukleazy 5'-3' (0) (posiada aktywność egzonukleazy 3'-5' i pollmerazy 5'-3'. W stosunku do enzymu wyjśdowego jest pozbawiony aktywnośd egzonukleazy S'-3', jest ona bowiem kłopotliwa ze względu na to że, może degradować startery związane z matrycą jak również może usuwać grupę 5'-fosforanową z końców DNA, które później będziemy chdeli poddać ligacjl)

c) wykorzystywany do znakowania schowanych 3‘ (1) (wypełnianie I znakowanie schowanych końców 3' dsDNA)

d) w sekwancjonowanlu DNA (1) (ale tylko metodą dldeoksypochodnych, przestarzała metoda)

Poza tym wykorzystywane też do syntezy drugiej nld cDNA I miejscowo-specyficznej mutagenezy z wykorzystaniem syntetycznych oligonukleotydów.

4.    His Taq w białku rekombinantowym:

a)    zwykle nie wpływa znacząco na jego strukturę, funkcje i właściwości (1) (spowodowane jest to małymi rozmiarami ogonka hlstydynowego tj. His Taq)

b)    pozwala na jego oczyszczanie na złotu z tlenkiem fenyloarsenu (0) (złożem do oczyszczania białka rekomblnantowego jest kompleks Nl-kwas metylotrójoctowy sprzężony ze złożami o charakterze wlelocukrowym. Złoża wlelocukrowego z tlenkiem fenyloarsenu używa się do oczyszczania tylko jeżeli białko jest zfuzjowane z tloredoksyną)

c)    stanowi sekwencję docelową dla enteroklnazy (0)

d)    umożliwia detekcję metodą Western Biot (1) (w przypadku białek rekomblnantowych jest to metoda klasyczna, do detekcji tą metodą można wykorzystać przeciwciało antyhlstydynowe)

5.    Nlck-translatlon inaczej metoda translacji nadęć, wykorzystywana do znakowania sond hybrydyzacyjnych. Przebieg procesu: wychodzimy od matrycy, która jest nadtrawiana niewielką Ilością DNAzy I (generuje ona pewne nadęcia w wyjściowej cząsteczce DNA). Nadęda te służą później jako miejsca prtmlngu dla cząsteczek pollmerazy I która w nie wchodzi I do końca 3' dobudowuje nowe nukleotydy - do tego służy aktywność pollmerazy 5'-3'. jeżeli substraty (deoksyrybonukteotydy), będą znakowane (haptenaml lub Izotopowo), to syntezowany oddnek DNA będzie wyznakowany. O translacji nadęć mówimy w tym przypadku dlatego, że synteza przez pollmerazę I sprzężona jest z trawieniem nld DNA znajdującej się przed enzymem - nadęcie wygenerowane przez DNAzę I w wyniku aktywnośd pollmerazy jest przesuwane wraz z jej aktywnośdą. Wytrawianie poprzedzającego odcinka DNA jest aktywnością analogiczną do wytrawiania starterów RNA w czasie replikacji (5'-3')

6.    BAC'i (sztuczne chromosomy bakteryjne są to odpowiednio przekonstruowane plazmidy płciowe E.coli)

a)    mogą występować w systemie binarnym (1) (wtedy mówimy o BIBAC'ach czyli blnary bacterlal artificial chromosome)

b)    pomieszczą Insert do 1000 kb (0) (kodują b. duże odcinki DNA do ok. 350 kb, zazwyczaj 200kb)

c)    w komórce występuję w formie liniowej (0) (BAC1 są koliste a YAC'I są liniowe)

d)    wprowadza się ja do komórki metodą alakrtotransfuzjl (1) (prawda jeżeli elektrotransfuzja * elektroporacja)

BAC'I są wykorzystywane do konstrukcji bibliotek genomowych które służą do: Izolacji określonych genów, mapowania fizycznego, sekwencjonowanie genomu. Klony w BAC'ach są często materiałem wyjśdowym do syntezy sond dla eksperymentów FISH tzn. fluorescencyjnej hybrydyzacji In situ.