3582469111

Metody kultur in vitro

Wykład 2. Laboratorium kultur in vitro. Podłoża hodowlane.

1. Wyposażenie i zasady pracy w laboratorium roślinnych kultur in vitro.

Laboratorium kultur in vitro musi składać się przynajmniej z trzech oddzielnych pomieszczeń, a każde z nich ma służyć odrębnemu etapowi zakładania i prowadzenia kultur:

•    pomieszczenie przygotowania pożywek i sterylizacji (pożywek, miejsca pracy, narzędzi oraz roślin);

•    pomieszczenie z komorą laminamą do pracy sterylnej;

•    pomieszczenie hodowli roślin.

Przygotowanie pożywek wymaga:

•    podstawowego sprzętu laboratoryjnego w postaci:

o szkoła laboratoryjnego; o wagi; o pH-metru;

o mieszadła magnetycznego;

•    podstawowych składników pożywek:

o soli jako źródła makro- i mikroelementów; o witamin; o cukru; o agaru;

o regulatorów wzrostu; o wody dej onizowanej;

•    autoklawu parowego lub mikrofalowego służącego do sterylizacji, który jest szybszy, ale sterylizuje mniejsze ilości materiału.

Naczynia hodowlane mogą stanowić każde, odpowiednio przygotowane, wysterylizowane i spełniające wymagania pojemniki szklane lub plastikowe np.: słoiki, pudełka (różnego pochodzenia), zlewki, probówki, szalki z przezroczystymi lub nieprzepuszczającymi światła wieczkami.

Komora laminarna - wyposażone w filtr HEPA urządzenie wykorzystywane do pracy laboratoryjnej w warunkach sterylnych z laminamym przepływem powietrza i możliwością sterylizacji promieniowaniem ultrafioletowym. Komory laminame można podzielić ze względu na klasy bezpieczeństwa:

•    I, II - stanowią komory otwarte, w których powietrze po przejściu przez filtr HEPA i całą komorę w końcu wylatuje na zewnątrz:

o w klasie I powietrze to wydostaje się na zewnątrz, w klasie II powietrze zostaje recyklowane w środku;

•    III - stanowi komora zamknięta, która służy do pracy z bardzo niebezpiecznymi organizmami lub substancjami (nie dotyczy roślin).

W odpowiednio przygotowanej komorze laminamej powinny znaleźć się sterylne: narzędzia, szkła i plastiki (np. końcówki do pipet), palnik, naczynia hodowlane i pożywki, pipety, etanol do sterylizacji narzędzi, środki do dezynfekcji powierzchni, rąk oraz przedmiotów „z zewnątrz”, a także pisaki, statywy i parafilm. Sterylizacja laminaru polega na wstępnej dezynfekcji powierzchni płaskich etanolem a następnie wystawienia całej komory na działanie promieniowania UV przez około 20 minut. Po zakończonej pracy w komorze laminamej przygotowane hodowle umieszcza się w fitotronach lub komorach hodowlanych (charakteryzujących się bardziej kontrolowanymi warunkami).