5083322564

Streszczenie wyników badań realizowanych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w roku 2014,

finansowanych przez Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi.

Temat zadania nr 44: „Identyfikacja i zastosowanie fenotypowych i molekularnych markerów tolerancji na stres suszy u buraka cukrowego"

Miejsce realizacji zadania: Katedra Fizjologii Roślin, Wydział Rolnictwa i Biologii, SGGW.

Kierownik zadania: dr Danuta Chołuj

Wykonawcy tematu: dr Anita Wiśniewska, prof. dr hab. Sławomir Podlaski, mgr Adam Sitarski (Kutnowska Hodowla Buraka Cukrowego)

Celem zadania było oszacowanie tolerancji genotypów buraka cukrowego na suszę oraz wybór genotypów skrajnie różniących się reakcją na ten stres oraz wstępna analiza polimorfizmu DNA wśród badanych genotypów.

W ramach zadania realizowano dwa tematy badawcze:

Temat badawczy 1: Analiza cech morfologicznych i fizjologicznych oraz oszacowanie ilości i jakości plonu w reakcji na suszę u genotypów rodzicielskich w doświadczeniach pod osłonami i wazonowych w szklarni

Cel tematu badawczego 1: Celem tematu było oszacowanie stopnia zróżnicowania tolerancji genotypów buraka cukrowego na suszę oraz wybór genotypów skrajnie różniących się reakcją na ten stres. Dodatkowo badania miały na celu wybór cech morfologicznych i fizjologicznych, które najlepiej charakteryzują reakcję roślin buraka cukrowego na niedobór wody w glebie.

Temat badawczy 2: Wstępna ocena polimorfizmu wybranych genotypów buraka cukrowego.

Cel tematu badawczego 2: Analiza dystansu genetycznego wybranych genotypów buraka cukrowego i jego powiązanie z ich reakcją na suszę na poziomie morfologicznym i fizjologicznym.

Materiał i Metody

Badania przeprowadzono na 12 genotypach buraka cukrowego wybranych w porozumieniu z pracownikami KHBC (Kutnowska Hodowla Buraka Cukrowego, Straszków). Pierwsze jedenaście linii były to podwojone haploidy, wykorzystywane przy uzyskiwaniu mieszańców FI jako formy męskie - zapylacze. Ostatni genotyp (nr 12) była to płodna linia O, która użytkowana jest w hodowli do rozmnażania żeńskich, męskosteryInych form. W ramach tego zadania przeprowadzono dwa doświadczenia.

W Doświadczeniu 1. rośliny uprawiano w szklarni SGGW w wazonach typu Wagnera. Początkowo wszystkie wazony podlewano co dwa dni do 60 % KPW (kapilarnej pojemności wodnej), po ówczesnym oznaczeniu jaką masę powinien osiągnąć wazon z podłożem, aby uzyskać taką wilgotność podłoża. Po miesiącu od wschodów zróżnicowano podlewanie roślin. Rośliny traktowane suszą zaczęto podlewać do 30 % KPW, a kontrolne nadal do 60 % KPW. Pomiar cech morfologiczno-fizjologicznych wykonano dwukrotnie po 30 i 45 dniach od momentu traktowania roślin suszą.

Doświadczenie 2. prowadzono na polu doświadczalnym KHBC w namiotach foliowych, które w czasie upalnych dni z wysokim natężeniem napromieniowania intensywnie wietrzono. W celu wyeliminowania podsiąkania wody z zewnątrz, po wewnętrznym obwodzie namiotów wkopano folię na głębokość około 1 m, a także wysiano neutralny genotyp. Na każdym poletku uprawiano 30 roślin w rozstawie 0,5 m x 0,2 m. Każdy genotyp uprawiany był na 4 poletkach dla danej kombinacji. Rośliny kontrolne, optymalnie zaopatrzone w wodę, codziennie automatycznie nawadniano. Dawki nawadniania wyliczano i zmieniano w czasie wegetacji zgodnie z wymaganiami dla poszczególnych faz rozwojowych roślin buraka. Rośliny traktowane suszą początkowo nawadniano tak samo jak rośliny kontrolne, a następnie po dwóch miesiącach od wschodów całkowicie wyłączono nawadnianie na okres około trzech miesięcy. W czasie indukowanej suszy glebowej trzykrotnie, co miesiąc, wykonano na roślinach obu kombinacji pomiary cech morfologicznych i fizjologicznych.

W obu doświadczeniach oceniano następujące cechy morfologiczno-fiz jo logiczne:

•    Stopień więdnięcia liści oceniano wizualnie wg skali od 1 do 6.

•    Względną zawartość wody (RWC) w liściach wyrośniętych.

•    Specyficzną masę liści (SLW) i współczynnik „sukulentności" wyrośniętych liści.

•Pomiar potencjału osmotycznego soku komórkowego wyrośniętych liści. Krążki bibuły wysycano sokiem komórkowym i umieszczano w komorze współpracującej z mikrowoltometrem HR-33T firmy Wescor. Po ustaleniu się stanu równowagi potencjał osmotyczny oznaczano metodą punktu rosy.

•Wskaźnik stopnia ulistnienia (LAi) oraz absorpcję fotosyntetycznie aktywnej radiacji (PAR) mierzono aparatem AccuPar (Hansatech, UK).

•    Współczynnik metabolizmu azotu (NBI),względną zawartość chlorofilu i flawonoidów w liściach wyrośniętych oznaczano za pomocą aparatu Dualex Scientific. Współczynnik metabolizmu azotu wyliczany jest ze wzoru: względna zawartość chlorofilu / względna zawartość flawonoidów.

•    Pomiary parametrów fluorescencji chlorofilu a w liściach zaadoptowanych do aktualnego natężenia napromieniowania wykonywano na liściach wyrośniętych, najbardziej aktywnych fotosyntetycznie za pomocą fluorymetru FMS-2. Na podstawie wartości fluorescencji stanu ustalonego - Ft, fluorescencji maksymalnej -Fm' i fluorescencji zmiennej - Fv'(Fm'-Ft) oznaczono efektywną wydajność kwantową PSII - Fv7Fm'. W trakcie pomiarów parametrów fluorescencji chlorofilu natężenie napromieniowania kształtowało się w zakresie od 1000 do 1400 umol nr² s*¹.

•Parametry fluorescencji chlorofilu a w liściach zaadoptowanych do ciemności badano fluorymetrem Heandy PEA (Hansatech, UK). Pomiary wykonano na liściach wyrośniętych po uprzednim ich zaadoptowaniu przez 30 minut w ciemności. Na podstawie krzywej indukcji fluorescencji analizowano następujące parametry: pole powierzchni nad krzywą fluorescencji (Am), fluorescencję minimalną (Fo), fluorescencję maksymalną (Fm), maksymalną wydajność kwantową PSII (Fv/Fm, gdzie Fv=Fm-Fo) oraz wskaźnik Fv/Fo.

W doświadczeniu wazonowym po 45 dniach suszy oznaczono powierzchnię blaszek liściowych za pomocą planimetru (LiCor, USA), suchą masę poszczególnych organów: blaszek liściowych, ogonków i korzeni oraz RWC, SLW i współczynnik sukulentności.

W doświadczeniu pod namiotami foliowymi zebrano rośliny z każdego poletka po 3 miesiącach suszy i oznaczono wielkość i jakość plonu korzeni (zawartość cukru, potasu, sodu i azotu-a-aminowego) standartowymi metodami na linii Venema stosowanymi w Kutnowskiej Hodowli Buraka Cukrowego.

Na podstawie średnich ze wszystkich terminów pomiarów wyliczano wskaźnik tolerancji poszczególnych genotypów na suszę (DTI - drought tolerance index) oddzielnie dla każdej z badanych cech stosując wzór: DTI = (Ys / Yk) / (średnia Xs / średnia Xk); Ys - średnia wartość cechy dla danego genotypu w warunkach suszy; Yk - średnia wartość cechy dla danego genotypu w warunkach optymalnego nawadniania; średnia Xs oraz średnia Xk - średnia wartość cechy dla wszystkich genotypów w warunkach suszy (średnia Xs) lub optymalnego nawadniania (średnia Xk).

Współczynnik ten obrazuje reakcję danego genotypu na tle uśrednionej reakcji wszystkich badanych genotypów pod względem danej cechy. Analiza tych współczynników pozwala na wybór genotypów różniących się tolerancją na suszę, co jest z jednym z celów tego tematu badawczego. Wartość DTI dla uśrednionej reakcji wszystkich genotypów wynosi 1, a gdy dana cech została obniżona pod wpływem suszy w porównaniu z kontrolą to wartości DTI powyżej 1 wskazują o podwyższonej tolerancji danego genotypu. W przypadku gdy niekorzystny wpływ niedoboru wody przejawia się podwyższeniem danego parametru to wartości DTI powyżej 1 wskazują na obniżoną tolerancję danego genotypu.

Do analizy molekularnej metodą RAPD wybrano 5 genotypów buraka cukrowego. Dobór linii do wstępnej analizy polimorfizmu był oparty o wyniki uzyskane w pracach polowych w 2014 r, a mianowicie wybrano linie różniące się skrajnie plonem korzenia oraz innymi cechami (wymienionymi w zadaniu 1.) w warunkach suszy, a także formę mateczną (12) o średnim plonie, ale wykorzystywaną w pracach hodowlanych. Do wstępnego określenia polimorfizmu zastosowano technikę RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) według Williams’a i wsp. z modyfikacjami (1990). DNA izolowano przy użyciu zestawu odczynników Genomie Mini AX Plant według instrukcji producenta (A&A Biotechnology) z liści buraków cukrowych rosnących w szklarni w warunkach optymalnych. Do amplifikacji polimorficznych produktów wykorzystano 185 dekamerów przeznaczonych do analizy RAPD, wytypowanych we wcześniejszych badaniach. Produkty PCR rozdzielano w 1,5% żelu agarozowym w buforze lx TBE do elektroforezy z dodatkiem bromku etydyny. Wynik rozdziału DNA zachowywano przy użyciu systemu do dokumentacji KODAK Gel Logic 200 Imagining System (Carestream Health. INC). Produkty RAPD były analizowane w oparciu o ich obecność (1) lub brak (0) u poszczególnych genotypów. Do oszacowania dystansu genetycznego wykorzystano program POPGENE.

Wyniki

Susza jest jednym z najważniejszych czynników środowiskowych ograniczających produktywność buraków cukrowych w warunkach klimatycznych Polski. Nawadnianie plantacji buraków nie jest właściwym rozwiązaniem tego problemu ze względów ekonomicznych, ale również z powodu zmniejszających się zasobów dostępnej wody. Podwyższenie plonowania buraków cukrowych w warunkach okresowych niedoborów wody można uzyskać poprzez wprowadzenie do uprawy odmian o obniżonej wrażliwości na ten stres. Uzyskanie odmian buraka o podwyższonej tolerancji na suszę metodami tradycyjnej hodowli jest trudne poprzez fakt, że odpowiedź roślin na ten stres jest regulowana przez wiele genów co wiąże się ze zmianami wielu cech biochemicznych czy fizjologicznych. Dlatego poznanie cech morfologiczno-fizjologicznych, które są powiązane z tolerancją buraka na niedobór wody może pozwolić na użycie ich jako kryteriów selekcji w programach hodowlanych.

W naszych doświadczeniach znacznie podwyższone u roślin traktowanych suszą wartości współczynników więdnięcia wskazują na utratę turgoru liści najstarszych i części wyrośniętych. Dodatkowo w warunkach uprawy w szklarni i pod namiotami foliowymi liście wyrośnięte więdły w ciągu dnia, ale po upływie nocy odzyskiwały turgor. Ponadto współczynnik więdnięcia zmieniał się pod wpływem suszy w sposób zróżnicowany u różnych genotypów buraka cukrowego a genotypy charakteryzujące się większą tolerancją na ten stres wolniej traciły turgor liści gdyż wskaźnik ten był ujemnie skorelowany z suchą masą korzeni i całej rośliny oraz z plonem korzeni. Prezentowane wyniki wskazują, że wraz ze znacznym podwyższeniem stopnia więdnięcia liści względna zawartość wody w liściach wyrośniętych w mniejszym stopniu obniżała się pod wpływem suszy i na niewielkie zróżnicowanie genotypowe tej cechy w reakcji na ten stres. Pomimo to wartości współczynników korelacji wyliczone dla RWC i suchej masy roślin lub plonu korzeni były istotne statystycznie. Stopień zmian RWC liści może być powiązany z ich reakcją osmoregulacyjną. W obu doświadczeniach obserwowano po wpływem suszy znaczne obniżenie potencjału osmotycznego liści. Obniżenie potencjału osmotycznego wynika głównie z akumulacji w komórkach buraka jonów potasu i sodu, rozpuszczalnych cukrowców i ich pochodnych oraz niskocząsteczkowych związków zawierających azot: betainy glicyny, proliny czy innych aminokwasów. Akumulacja osmoprotektantów jest niezbędna do utrzymania homeostazy stosunków wodnych w komórkach mezofilu liści, głównie pomiędzy wakuolą a cytozolem, co pomaga roślinie przetrwać okres suszy, ale osmoregulacja jest niewystarczająca do podtrzymania intensywności procesów wzrostowych. W naszych badaniach stopień obniżenia potencjału osmotycznego w reakcji na niedobór wody był zróżnicowany genotypowo, ale gdy rośliny uprawiano pod namiotami foliowymi nie stwierdzono korelacji pomiędzy tą cechą a plonem korzeni.

Niedobór wody spowodował u roślin buraka cukrowego zmiany morfologiczne liści przejawiające się podwyższeniem specyficznej masy liści i współczynnika sukulentności. Te zmiany mogą być powiązane z zahamowaniem wzrostu liści powodującym, że stają się one mniejsze i grubsze. Wyniki naszego doświadczenia prowadzonego pod namiotami foliowymi wskazują na ujemną korelację pomiędzy SLW i współczynnikiem sukulentności, a plonem korzeni. U roślin traktowanych suszą obserwowano wyraźne obniżenie akumulacji suchej masy, powierzchni blaszek liściowych i wskaźnika stopnia ulistnienia (LAi). Dodatkowo reakcja genotypów na niedobór wody w przypadku tych cech fizjologicznych była znacznie zróżnicowana. Stwierdzono również istotną statystycznie dodatnią korelację pomiędzy powierzchnią aparatu fotosyntetycznego, a wzrostem roślin czy plonem korzeni.

Przy wartościach LAI w granicach 3-4 rośliny buraka cukrowego bardzo efektywnie pochłaniają promieniowanie PAR i osiągają wysokie plony. W naszych badaniach rośliny optymalnie nawadniane charakteryzowały się średnimi wartościami LAI około 3, a w warunkach suszy w granicach 2, co negatywnie wpływało na absorpcję PAR przez aparat fotosyntetyczny. Absorpcja fotosyntetycznie aktywnej radiacji jest głównie determinowana przez powierzchnię i efektywność aparatu fotosynetycznego oraz jego długotrwałość. Wyniki naszych doświadczeń dowodzą, że susza wpływa negatywnie na względną zawartość chlorofilu w liściach wyrośniętych, aktywnych fotosytetycznie, co wskazuje na przyśpieszenie procesów ich starzenia się. Pomiar parametrów fluorescencji chlorofilu a jest wykorzystywany do oceny sprawności aparatu fotosyntetycznego. Pomiary te są szybkie, nieinwazyjne i łatwe w wykonaniu. Od wielu lat stosuje się je jako precyzyjne narzędzia do badania reakcji procesu fotosyntezy na niekorzystne czynniki środowiska. Generalnie aparat fotosyntetyczny buraka cukrowego jest stosunkowo odporny na dehydratację, choć w warunkach wysokiego natężenia napromieniowania i temperatury może dochodzić do okresowej fotoinhibicji. W naszych badaniach efektywna wydajność kwantowa reakcji fotochemicznej w PSII w bardzo niewielkim stopniu obniżała się pod wpływem niedoboru wody u roślin uprawianych w namiotach foliowych, ale wyraźne negatywne zmiany obserwowano, gdy suszą traktowano młodsze rośliny uprawiane w szklarni. Różnice te mogą wynikać z faktu większej wrażliwości na dehydratację młodszych liści, ale także wyższych temperatur w szklarni w porównaniu z warunkami pod namiotami. Analiza wartości parametrów fluorescencji chlorofilu a w liściach adoptowanych do ciemności pozwala określić na jakim etapie procesu transportu elektronów w obrębie fotosystemu drugiego występują zaburzenia wywołane przez niekorzystne czynniki środowiska. Wyniki naszych badań wskazują na podwyższenie wartości fluorescencji minimalnej w wyniku oddziaływania suszy, świadczyć to może o mniejszej sprawności przekazywania energii wzbudzenia pomiędzy cząsteczkami barwników w antenach PSII lub o zmniejszonej efektywności absorpcji energii przez centra PSII spowodowanej dysocjacją anten od rdzenia. Wartości fluorescencji maksymalnej uzależnione są między innymi od zawartości chlorofilu w liściach i obniżenie Fm obserwowane w naszych doświadczeniach w reakcji na niedobór wody może wynikać ze zmian zawartości barwników asymilacyjnych. Inną przyczyną zmniejszenia wartości Fm może być fakt, że pod wpływem suszy nie dochodzi do redukcji wszystkich akceptorów w PSII. Na takie zaburzenia, czyli zablokowanie transportu elektronów od centrów reakcji do plastochinonów wskazuje także znaczne obniżenie wartości pola powierzchni nad krzywą fluorescencji obserwowane w naszych badaniach. Inne zmiany w obrębie PSII mogą dotyczyć jego części donorowej czyli efektywności funkcjonowania układu rozszczepiania wody. Obniżenie wartości parametru Fv/Fo obserwowane w reakcji na suszę w naszych doświadczeniach świadczy o zmniejszonej wydajności systemu rozkładającego wodę jako donora elektronów do centrów PSII. W naszych badaniach obserwowano stopniowe obniżanie wartości maksymalnej wydajności kwantowej PSII w miarę przedłużania się suszy. Podsumowując wyniki naszych badań charakteryzujące wpływ suszy na funkcjonowanie aparatu fotosyntetycznego u roślin buraka cukrowego można stwierdzić, że w warunkach niedoboru wody i wysokiego natężenia napromieniowania oraz wyższych temperatur może dochodzić do okresowej fotoinhibicji, ale znaczne uszkodzenia fazy świetlnej fotosyntezy zachodzą tylko przy silnej dehydratacji. W naszych badaniach u roślin uprawianych pod namiotami foliowymi wykazano istotną statystycznie korelację pomiędzy plonem korzeni i wartościami wszystkich parametrów fluorescencji chlorofilu o, co wskazuje, że ich pomiar może być wiarygodnym wskaźnikiem oceny stopnia tolerancji aparatu fotosyntetycznego różnych genotypów buraków cukrowych na suszę.

U roślin traktowanych suszą plon korzeni był obniżony o około 40 % w porównaniu do kontroli. Ponadto stwierdzono bardzo duże zróżnicowanie genotypowe plonu korzeni w reakcji na suszę. Zawartość sacharozy w korzeniach spichrzowych była tylko nieznacznie podwyższona w reakcji na niedobór wody a zawartość sodu i potasu zbliżona u roślin traktowanych suszą i optymalnie nawadnianych. Pod wpływem suszy obserwowano natomiast znaczne podwyższenie zawartości azotu-a-aminowego. Cecha ta charakteryzowała się dużym zróżnicowaniem genotypowym oraz była ujemnie skorelowana z plonem korzeni.

Do wstępnego oszacowania genetycznego polimorfizmu na poziomie DNA pomiędzy 5 genotypami wykorzystano technikę RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA). Po przeprowadzeniu PCR obliczono, że spośród 158 użytych starterów, pomimo że były wybrane na podstawie wcześniejszych badań nad innymi genotypami buraka, tylko 55 generowało produkty polimorficzne, 7 - produkty monomorficzne, 7 nie dało żadnych produktów oraz 89 dało produkty niestabilne lub nieostre. W reakcjach ze starterami generującymi produkty polimorficzne pomiędzy genotypami uzyskiwano od 1 do 11 produktów. Długość amplifikowanych produktów wynosiła od ok. 400 do 3000 pz. Ogółem przy użyciu 55 starterów generujących fragmenty DNA polimorficzne zidentyfikowano dla 5 genotypów 274 loci (łącznie 948 produktów PCR), z których 196 stanowi loci polimorficzne (71,53 %). Dystans genetyczny oraz tożsamość genetyczną obliczono dla 5 genotypów rodzicielskich buraka cukrowego w oparciu o uzyskane dane RAPD. Wartość genetycznego dystansu wahała się od 31,98 do 51,33 %. Wartość dystansu genetycznego pomiędzy badanymi formami buraka zawiera się w przedziale wartości uzyskiwanymi wcześniej w innych badaniach (Chołuj i in., 2014).

Wnioski

1.    Tendencje zmian cech morfologicznych i fizjologicznych w reakcji na suszę były w obu doświadczeniach zbliżone, choć stopień obniżenia czy podwyższenia danej cechy był zróżnicowany. Dowodzi to, że wybrane do badań cechy właściwie charakteryzują reakcję buraka cukrowego na okresowe niedobory wody niezależnie od sposobu uprawy i aplikacji suszy oraz fazy rozwojowej rośliny w momencie traktowania stresem.

2.    Cechy, które wykazywały największe zróżnicowanie genotypowe pod wpływem okresowych niedoborów wody, a ich wartości ściśle korelowały z suchą masą roślin lub plonem korzeni mogą być zastosowane jako wskaźniki fenotypowe tolerancji genotypów buraka cukrowego na suszę. Należą do nich przede wszystkim cechy charakteryzujące powierzchnię i długowieczność aparatu fotosyntetycznego oraz niektóre parametry fluorescencji chlorofilu a obrazujące jego aktywność, czy zmiany morfologiczne liści.

3.    Analiza wartości wskaźników tolerancji na suszę, charakteryzujących reakcję danego genotypu na tle uśrednionej reakcji wszystkich genotypów, wyliczonych dla wszystkich cech morfologiczno-fizjologicznych w obu doświadczeniach wskazuje na obniżoną tolerancję na suszę genotypów 2 i 9, a podwyższoną genotypu 3 i 10.

4.    Na podstawie uzyskanego dystansu genetycznego oraz cech fizjologicznych można wskazać genotypy do krzyżowania, w celu uzyskania segregującego pokolenia F2 (planowanego w projekcie).