34806

być taka sama jak sekwencja powielana; starter wsteczny (ang. reverse) - jego sekwencja musi być komplementarna do powielanej. Hybrydyzacja komplementarnej nici rozpoczyna się kiedy dwa różne startery przyłączają się do ich komplementarnych fragmentów matrycy.

Enzym, polimeraza Taq rozbudowuje przyłączone startery sekwencji poprzez odczytywanie nici i syntetyzowanie komplementarnej sekwencji. Tym sposobem, enzym powiela nić DNA. Polimeraza Taq została wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus. Jest to gatunek bakterii, który dobrze znosi wysokie temperatury. Pierwszy raz odkryto ją w gorących źródłach Narodowego Parku Yellowstone. Enzym pochodzący z tych bakterii znosi bardzo wysokie temperatury, optymalna temperatura dla rozwoju tych bakterii to 100°C, co sprawia, że enzym ten jest idealny do PCR.

Reakcja PCK - krok po kroku

Ampliflkacja PCR obejmuje trzy główne etapy, denaturację, przyłączanie starterów oraz elongację.

Podczas dcnaturacji, mieszanina podgrzewana jest do 93-94°C (T_m - temperatura rozdzielania, ang melting temperaturę) przez 30 sekund, czego wynikiem jest rozdzielenie podwójnej nici DNA naszej matrycy na dwie pojedyncze nici. Zanim polimeraza zacznie generować nowe kopie każda matryca musi zostać rozdzielona. Tak wysoka temperatura wymagana do rozdzielenia nici DNA normalnie zniszczyłaby aktywność większości enzymów, jednak polimeraza Taq jest odporna na taką temperaturę.

Etap przyłączania się starterów polega na ich łączeniu się z wybraną komplementarną sekwencją pojedynczej nici matrycowego DNA. W tej pozycji rozpoczynają one działanie polimerazy Taq, która przedłuża i buduje nową komplementarną nić poprzez dołączanie kolejnych nukleotydów, czyli syntezę dwuniciowej sekwencji DNA. Przyłączanie starterów do matrycy DNA w dużym stopniu jest zależne od temperatury. Optymalna temperatura (T* - ang. atmealing temperaturę) mieści się w przedziale 40-60°C i zależy od ich długości oraz składu. Wylicza się ją ze wzoru. Amplifikacja PCR, która zostanie wykonana na tych ćwiczeniach została wcześniej zoptymalizowana pod względem temperatury przyłączania starterów.

Podczas elongacji, polimeraza Taq dodaje po jednym nukleotydzie (A, T, G, C) od miejsca przyłączenia startera syntetyzując komplementarną kopię matrycy DNA. Podczas polimeryzacji, temperatura reakcji wzrasta do 72°C, jest to optymalna temperatura dla aktywności polimerazy.

Te trzy główne etapy: denaturacja, przyłączanie starterów oraz elongacja, tworzą razem jeden cykl reakcji PCR. Całkowita amplifrkacja PCR wymaga zazwyczaj 30-40 cykli. PCR przeprowadzany jest w termocyklerze zawierającym aluminiowy blok, w którym umieszczone zostają próby. Termocykler gwałtownie ogrzewa i gwałtownie chłodzi blok w zakresie wymaganych temperatur. Gwałtowne ogrzewanie lub chłodzenie bloku jest definiowanie jako cykl termiczny.

Ćwiczenie ma na celu przeprowadzenie przez każdego studenta reakcji PCR dla prób DNA wyizolowanych na poprzednich zajęciach.