Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego związana jest z podwyższeniem stanu energetycznego pochłaniającej cząsteczki. Zależy ona głównie od liczby i rozmieszczenia elektronów w cząsteczce lub jonie bądź Gd występowania w jej strukturze charakterystycznych ugrupowań atomowych. Zbadanie zależności stopnia absorpcji światła od długości fali przez odpowiednio przygotowaną próbkę, pozwala na uzyskanie tzw. widma absorpcyjnego badanego związku.
Możliwość wykorzystania zjawiska absorpcji promieniowania świetlnego przez materię do oznaczeń ilościowych wynika z faktu, że stopień osłabienia wiązki światła przechodzącego przez badaną próbkę jest proporcjonalny zarówno do jej grubości, jak i do stężenia w niej substancji czynnej. Zależność tą opisuje prawo Lamberta - Beera :
I - natężenie wiązki promieniowania po przejściu przez absorbującą próbkę
I - natężenie wiązki padającej k - współczynnik proporcjonalności 1 - grubość absorbującej warstwy c - stężenie absorbującej warstwy
Przekształcenie tego równania w wyniku logarytmowania pozwala uzyskać:
gdzie A oznacza absorbancję definiowaną jako wartość logarytmu stosunku natężenia wiązki padającej do natężenia wiązki przechodzącej przez badany ośrodek.
Efektem pomiaru spektrofotometrycznego jest zwykle wartość absorbancji, Jest ona wielkością charakteryzującą czułość metod spektrofotometrycznych.
Jeżeli dla późniejszych interpretacji wyników ważniejsze jest promieniowanie przepuszczone niż chemiczne właściwości badanej