101946

Przygotowanie i łączenie fragmentów DNA:

1)    Tworzenie i łączenie lepkich (wystających) końców z wykorzystaniem jednego enzymu (DNA z dwóch różnych źródeł)

Inaktywacja DNA (po inaktywacji restryktaz!!!)

2)    Hydroliza różnymi restryktazami, tworzenie komplementarnych końców (lepkich) i ich łączenie (na przykładzie BamHI, Bglll, Bell, Sau3A). DNA z jednego lub innych źródeł.

Ligaza DNA

3)    Formowanie tępych (płaskich) końców przez wypełnianie lepkich końców powstałych po hydrolizie enzymami, które nie tworzą końców wobec siebie komplementarnych (np. H mdl II, EcoRl, BamHl).

Polimeraza DNA, dNTP, ligaza DNA + ATP (po inaktywacji restryktaz)

4)    Tworzenie i łączenie płaskich końców w wykorzystaniem różnych restryktaz (np. Haellł. Smal,

Al ul)

Ligaza DNA + ATP (duży nakład)

5)    Tworzenie komplementarnych lepkich końców poprzez częściowe wypełnianie końców Sali

Polimeraza, dTTP, DTP BamHl

Polimeraza. dATP, Stp.

Ligaza DNA

6)    Łączenie lepkich końców za pomocą syntetycznych adapterów EcoRl

Adapter BamHl Ligaza DNA

Istnieje możliwość wprowadzania pożądanych miejsc restrykcyjnych do początku i końca sekwencji kodujących genu, co pozwala w kolejnych etapie na ściśle określoną inercję genu w odpowiednio przygotowany wektor.

Do inaktywacji zamiast 65°C wykorzystuje się czasem fenol

Efektywność hydrolizy DNA:

Szybkość i kompletność hydrolizy związana jest z:

•    Czystością preparatu

•    Poziomem jego metylacji (hamuje reakcję)

•    Doborem warunków trawienia (bufor, proporcje DNA: enzym)

Liczne szczepy, z których izoluje się plazmidy zawierają specyficzne metylazy (dam- metyluje A w obszarze GATC i dcm metyluje wewnętrzną C w CC(A/T)GG).

Inhibują one działanie licznych enzymów.

Plazmidowy DNA izolowany z takich szczepów może być oporny na hydrolizę.

Lepiej transformować, a później izolować plazmidy ze szczepów dam- czy dcm-.

Eukariotyczne DNA zawiera pewien %5mC (szczególnie u roślin, istotne różnice na poziomie tkanek).

Ilość DNA przeznaczona do analiz restrykcyjnych 0,2-2pg dla Prokaryota i 5-10pg dla Eukaryota.

W I przypadku w wyniku hydrolizy powstają nieliczne, zdefiniowane fragmenty.

W II- charakterystyczne smugi DNA z pasmami frakcji repetytywnych na ich tle (po elektroforezie)

Alternatywne (mechaniczne) metody fragmentacji DNA Shearing przy użyciu strzykawki z igłą.

Stopień fragmentacji zależy od grubości igły i ilości przypuszczeń.

Uzyskuje się fragmenty zakończone tępo (nici DNA pękają zwykle naprzeciwko siebie).