71214

Na czyni polega różnica w sekwencjonowaniu metodą Sangera i PCR sekwencyjnym?

Meloda sekwencjonowania długich cząsteczek DNA polega na wytworzeniu zbioru cząsteczek różnej długości, z jednym typowym końcem. Cząsteczki te następnie są rozdzielane elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowymy (PAGE) co pozwala odczytać sekwencje badanego DNA.

Sekwcncjonowanie metodą Sangera (dideoksy) polega na enzymatycznej replikacji jednoniciowego lub uprzednio zdenaturowanego fragmentu lub klonu DNA w obecności trifosforanów 2’3’-dideoksyrybonukeozydów. Synteza rozpoczyna się od startera (przyłącza się do jednoniciowej matrycy i polimeraza DN A wykorzystując dNTP wydłuża starter), hybrydyzującego z matrycą w określonym, pojedynczym miejscu, a kończy wbudowaniem dideoksyrybonukleotydu do nowo powstałego łańcucha DNA. Badaną próbkę dzieli się na cztery porcje, oznaczone: A, C. G i T. Każda z nich zawiera tę samą matrycę, starter, mieszaninę czterech trifosforanów deoksyrybonukleozydów, odpowiedni bufor, pohmerazę DNA oraz jeden z ddNTP. odpowiednio: ddATP, ddCTP, ddGTP lub ddTTP Stężenie ddNTP ntusi być tak dobrane, by zapewniało inkorporację średnio jednego ddNTP w trakcie syntezy jednego łańcucha DNA, o długości 200,400 czy 800 nt. Zdcnalurowanc produkty syntezy- oddzielone od matrycy i pozbawione struktur II rzędowych rozdziela się elektroforetycznie w czterech oddzielnych ścieżkach 6-8% żelu poliakryatnidowego zawierającego 7M moczitik, w temperaturze 55-70'C.

Dideoksynukleotydy działają jako terminatory wydłużania łańcucha ponieważ nie zawierają grupy 3' -OH (obecność tej grupy jest niezbędna aby polimeraza mogła wydłużyć rosnący łańcuch). Znacznik można wprowadzić na etapie syntezy (stosując jako jeden z substratów np. [alfa-35S]dATP) lub można użyć już znakowany starter Starter znakuje się albo za pomocą związków radioaktywnych albo barwników fitorescencyjnych.

Badana matryca powinna być pojedynczym klonem, homogermym produktem PCR, a w przypadku bezpośredniego sekwencjonowania genotnowego DNA, powinna pochodzić z jednego organizmu DNA powinien być odbialczony (zazwyczaj plazmidowy DNA przygotowany standardowa metodą lizy alklicznej może być z powodzeniem sekwencjonowany. lecz doczyszczenie niektórych preparatów daje dobre efekty). Innym, istotny czynnikiem decydującym o dobrej jakość wyników jest maksymalna wybiórczość i wydajność hybrydyzacji stosowanego startera z badanym DNA, Optymalny, molowy stosunek startera do jednoniciowej matrycy wynosi 1:1 ( w przypadku matryc dwuniciowych stosuje się dwukrotny nadmiar startera).

Pytanie to nie jest dokończone... :( na katedrze kazali czekać na wykład, jak ty lko będzie to szybciutko dokończę :) W razie jakiś problemów' proszę pisać :)