74659

SKŁADNIKI MIESZANINY REAKCYJNEJ: matrycowe DNA: starter: MgCI? dNTP, polimeraza: bufor do PCR.

•    MATRYCOWE DNA: nie może być zdegradowane ani zanieczyszczone. Inhibitorami PCR są m.in. fend. EDTA. proteinoza K. Najczęściej w 20 pl mieszaniny reakcyjnej stosuje się 10-100 ng matrycy. Zbyt duża ilość DNA powoduje amplifikację niespecyficznych produktów DNA.

•    STARTER (primer): Starter jest jednoniciowym fragmentem DNA o dł. 18-28 par zasad (pz. bp). Zawartość GC powinna wynosić 50-60% i powinny być one równomiernie rozłożone na całej długości startera. Starter nie może być komplementarny do samego siebie ani do innych starterów w mieszaninie reakcyjnej. Temperatura topnienia starterów flankujących dany fragment nie powinna różnić się o więcej niż ^C. Jeśli dysponujemy sekwencją matrycowego DNA, należy rozpatrzyć wszystkie możliwe miejsca przyłączenia starterów. Optymalne stężenie starterów to 0,1-0,5 pM.

•    MgCI? Jony Mg^? są kolektorami polimerazy DNA. Stężenie jonów magnezu powinno być dobrane eksperymentalnie ze względu na to, że tworzą kompleksy z takimi składnikami reakcji jak: DTP, startery i matrycowe DNA. Dokładność PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów Mg'*" Zbyt mała ich ilość obniża ilość produktów PCR. zaś zbyt duża powoduje pojawienie się produktów niespecyficznych. Z reguły stosuje się stężenie jonów Mg w zakresie 1-4 mM. Jeśli matrycowe DNA zanieczyszczone jest związkami chelatującymi np. EDTA, należy podwyższyć stężenie Mg^?

•    dNTP: jest to mieszanina deoksynukleozydotrifosforanów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Stężenie w roztworze powinno wynosić 20-200 pM każdego nukleotydu. Ważne jest aby w mieszaninie reakcyjnej stężenie każdego dNTP było jednakowe, ponieważ nadmiar lub niedobór chociaż jednego z nukleotydów powoduje ich mylne przyłączenie w trakcie amplifikacji. Są wrażliwe na warunki, dlatego przechowuje się je w temp. -2CfC. Rozkład dNTP jest bardzo często przyczyną braku produktu PCR.

•    Polimeraza DNA: zazwyczaj używana jest 2-3 p polimerazy Taq na 100 pl mieszaniny reakcyjnej, wyższe stężenia polimerazy mogą powodować amplifikację produktów niespecyficznych. Jednakże jeśli w mieszaninie reakcyjnej znajduje się inhibitor polimerazy np. matrycowe DNA, jest zanieczyszczona, wówczas wyższe ilości polimerazy (4-6 p /100 pl) mogą zwiększyć amplifikację. Ze względu na wrażliwość na zamrożenie i odmrożenie zaleca się przechowywanie polimerazy w -2Cf C oraz wyjmowanie tylko na czas dodania enzymu do reakcji.

•    Bufor do PCR: jego pH w zależności od polimerazy wynosi 8.3-8,8. Stężenie Tris-HCL mieści się w zakresie 10-15 mM. Często zawiera ok. 50 mM KCI,