83330

II.

Obserwacje komórek w mikroskopie fluorescencyjnym

Obserwacja zjawiska autofluorescencji

1.    Obserwacja autofluorescencji clilorofllu

Wykonaj preparat w kropli wody ze skórki spodniej strony liścia trzykrotki (Tradescatuia) zaobserwuj w mikroskopie fluorescencyjnym autofluorescencję chlorofilu.

Zastosowanie barwników fluorescencyjnych

2.    Wykryyaiiekaloiy w ikankadi roślinnych za pomocą błękitu aniliny

Błękit aniliny nie jest fluorodiromem i jako taki fluorescencji nie daje. Fluorescencja pojawia się dopiero po połączeniu błękitu aniliny z kalozą (mechanizm tej reakcji nie jest wyjaśniony).

Odczynniki:

•    Błękit aniliny (rozpuszczalny w wodzie)

•    1 M roztwór glicyny o pH 9.5

Przygotować 0,005% roztwór błękini aniliny w 1 M roztworze glicyny o pH 9.5 Wykonanie preparatu:

Preparaty z wewnętrznej skórki okrywowej łuski cebuli wykonać tak jak w poprzednich ćwiczeniach.

•    Zbadać autofluorescencję komórek skórki cebuli.

•    Zbadać fluorescencję komórek skórki cebuli po traktowaniu błękitem aniliny, zwracając uwagę na świecenie kalozy plazmodesmowej.

Wykonaj w zeszycie rysunki i wyciągnij wnioski z przeprowadzonych obserwacji.

III.    Barwienie przyżyciowe

1. Baratuic przyżyciowe czerwienią obojęmą

•    Przygotuj trzy szkiełka zegarkowe z trzem różnymi stężeniami czerwieni obojętnej (roztwór wodny): 1: 1000, 1: 10 000 i 1: 100 000.

•    Przygotuj małe skrawki z epidermy łuski spichrzowej cebuli (Alliian cepa) i także zanurz je w barwniku. Aby prawidłowo wykonać preparat, należy rozkroić skalpelem cebulę, wyjąć jedną łuskę i naciąć jej wewnętrzną (wklęsłą) powierzchiuę w kwadraty o boku ok. 5 mm. Następnie za pomocą igły preparacyjnej zdjąć bardzo ostrożnie (aby nie uszkodzić komórek) epidermę i przenieść ją do roztworu barwnika.

Uwaga: dopił mg, aby skrawki tkanki były zanurzone w barwniku, a nie pływały po powierzchni.

•    Skrawki barw w temperaturze pokojowej przez ok. 10 minut.

•    W czasie barwienia przygotuj szkiełko podstawowe i trzy szkiełka nakrywkowe, a w zeszycie do ćwiczeń narysuj tabelę obserwacji wedhig wzoru:

	Czerwień obojętna
stężenie	1: 100	1: 10 000	1: 100 000
Jądro komórkowe
Plastydy
Wakuola
Ściana komórkowa
Żywotność komórek

•    Po wybarwieniu wykonaj na jednym szkiełku trzy preparaty (po 1 z każdego stężenia barwnika) w kropli wody i przeanalizuj pod mikroskopem.

•    Pozytywny wynik barwienia danej struktury zaznacz znakiem +. negatywny znakiem -

Hf'

,jCOX

Czerwie* obotetta

Po wypebiieniu tabeli zanotuj w zeszycie wynik kotkowy doświadczenia dający odpowiedzi na pytania:

A.    Które z badanych stężeli jest optymalne dla komórek Allium (pamiętaj o warunku zachowaiua żywotności większości komórek).

B.    Barwnikiem jakiej struktury (względnie struktur) jest czerwieii obojętna.

2