84753

Narzędzia enzymatyczne można podzielić na cztery grupy (mówimy o enzymach do DNA)

•    nukleazy - przecinają cząsteczki DNA

•    ligazy - łączą cząsteczki DNA ze sobą

•    polimerazy - tworzą kopię cząsteczki DNA

•    enzymy modyfikujące DNA - usuwają lub dodają grupy chemiczne.

Nukleazy

W wyniku przecięć otrzymujemy krótsze cząsteczki DNA. Mogą również na koniec ulec degradacji. Ich działanie polega na hydrolizie wiązań poliestrowych, które występują w DNA

EgroruAleaia

i

hydrolizowanej. Prefemje DNA które jest pojedynczymi nićmi. Możemy również hydrolizować DNA typu SI, ale takie, które mają brak nukleotydów na jednej nici.

Nck

i

m. tttt

• DNaza 1 - brak preferencji w odniesieniu do sekwencji. ale jej substratami są cząsteczki zarówno ds. jaki ss.

i

Oęde

i

ON aa 1

mmmraram-

Wiązanie wodorowe

Cięcie Wiązani* fosfodiestrowe

zmnmmmnz

i

: imzzmmm::

nmm m mn nznm

Dwa typy nukleaz:

•    egzonukleazy - hydrolizują wiązania, które znajdują się na końcach cząsteczki DNA. Pizy dłuższym prowadzeniu tej reakcji cząsteczka może ulec całkowitej hydrolizie.

•    endonukleazy - hydrolizują wiązania w obrębie cząsteczki DNA (wewnątrz). W tym wypadku również cząsteczka może ulec całkowitej hydrolizie.

• enzymy rcstrykcyjnc/rcstrytkazy - działają bardzo specyficznie, wyraźne preferencje co do sekwencji (na obrazku było pokazane, że przędna tylko formę ds).

Ligazy

Naprawiają fragmenty DNA pizez odtworzenie wiązania fosfodiestrowego (w kom). W laboratorium wykorzystujemy tę informację do łączenia dwóch cząsteczek DNA.

Przykłady egzonukleaz:

•    Bal31 - przecina cząsteczkę DNA. Zarówno od końca 5’jak i 3’. Zatem może skutecznie skracać cząsteczkę. Kontrola jest kontrolą czasową, ale brak dokładności, bo w każdym roztworze mamy molekuły ulegające niezależnej reakcji.

WlfT Formalnie Bal31 używamy jako egzonukleaza, ale dokładniejsze badania {text missing}

Dlaczego tak jest? Bal 31 jest endonukleazą, ale nie zdolną do adaptowania takich fragmentów DNA, które są w prawidłowej strukturze typu ds, tzn. takiej, która jest stabilizowana przez wiązania wodorowe. Natomiast końce cząsteczki DNA często ulegają fluktuacjom termicznym. Dlatego też cz. DNA otwiera się i zamyka, jest niestabilna i pizez pewien czas jedna i druga nić są niesparowane. Wtedy Bal31 ma ułatwiony dostęp i może hydrolizować.

Ale formalnie egzonukleaza! i to mamy zapamiętać.

•    egzonukleaza 3 charakteryzuje się już pewną specyficznością - hydrolizuje wiązania w 3’ końcu.

Polimerazy

Syntezują nowe cząsteczki DNA (RNA), które są komplementarne do matrycy wymagania: staiteiy, matryca, dNTP, jony Mg^:*

Przykład - Polimeraza DNA 1 posiada

•    aktywność polimerazową 5’ —* 3’

•    aktywność korekcyjną 3’ —* 5’

•    aktywność nuklcazową 5’ —* 3’

Nick nadęde forma typu nick - polimeraza wypełnia brakujący fragment DNA przy pomocy swoich trzech aktywności. Reakcja ta jest ważna, bo można znakować DNA radioaktywnie (dNTP są znakowane radioaktywnie).

•    fragment Klenowa - pochodna polimerazy DNA 1

Po użyciu odpowiedniego enzymu proteolitycznego polimeraza DNA1 jest pozbawiana aktywności nukle-azowej 5’—* 3’. Podczas np. sekwencjonowania DNA, ta aktywność jest niekorzystna.

Przykłady endonukleaz:    I Różnice między otrzymanymi produktami po rc

SI - nie ma wymagań, co do konkretnej sekwencji akcji polimeiyzacji