84756

wrotnej transkryptazy.
	Odwrotna transkryptaa
	Degradacja nici RNA

i

Standardowe PCR

W (1) było najwięcej DNA, ponieważ potrzeba było inniej cykli, aby osiągnąć wymaną ilość produktu. W 2 i 3 wymagana była większa ilość cykli.

Sygnał jest mierzony dla konkretnej wartości, który jest dostatecznie pewny, tzw. próg pomiaru.

Po ustaleniu progu pomiaru mierzy się, po jakiej liczbie cykli próbka przekroczy próg pomiaru.

RT-PCR może też słźyć do analizy ilości transkryp-tu (nie tylko DNA), wygląda jak standardowy PCR, ale najpierw musimy uzyskać matrycę. Potrzebujemy od-

Do czego jest nam to potrzebne?

•    do wykrywania wirusów patogennych z RN A

•    do analizy ekspresji genu

Sekwencjonowanie genów i genomów

Początki sekwencjonowania sięgają lat 70’ ubiegłego wieku.

Metoda Sangcra - używana do sekwencjonowania małych genomów. Metoda ta wykorzystuje techniki elektroforezy wykonywanej w szczególnych warunkach - odróżniane są produkty różniące się jednym nu-kleotydem. W tej metodzie stosowany jest wysokorozdzielczy żel poliakryloamidowy i cząsteczki DNA są całkowicie z denaturowane. Denaluracje uzyskuje się dzięki mocznikowi oraz temperaturze.

Opis metody: Dysponujemy (jcdnoniciowym) DNA. Jednoniciowy, bo wykorzystujemy reakcję po-limerazową. Do reakcji wykorzystujemy dNTP, matrycę, startery, polimcrazę oraz dideoksynukleotydy (związek ten w pozycji 3 nie posiada grupy OH. tylko H, grupa OH potrzebna jest do wydłużania łańcucha). Należy pamiętać, że dNTP —» ddNTP (dideoksynukle-otydów). Otrzymujemy kolekcję DNA o różnych długościach. W zależności od tego, w których miejscach został przyłączony ddNTP. Dodatkowy każdy ddNTP jest znakowany różnym kolorem fluorescencyjnym. Przy pomocy elektroforezy i detektora. Otrzymujemy informacje na temat długości (...)

Poliincrazy używane do sekwencjonowania:

•    polimeraza DNA1 - (na początku) posiada aktywność nukleazową, co prowadziło do hydrolizy produktów.

•    fragment Klenowa - pozbawiony aktywności nuklcazowej 5’—*3’. Problemem jest to, że jest mało procesywny (jest dłgo związany z matrycą).

•    sekwenaza - pochodna polimerazy z faga T7. Nie posiada aktywności egzonukleazowcj 5’—*3’, wysoko procesywna (ponad 700 pz), akceptuje pochodne nu-kleotydów.

Skąd pojedyncza nić? Na przykład z faga M13, ale fragmenty nie są długie; użycie fagemidów; denatura-cja DNA.

Sekwencjonowanie termiczne

Po pierwsze cząsteczka DNA jest denaturowana przez temperaturę. Następnie, w konkretnej temperaturze jedna z nici hybrydyzuje ze starterem. Produkt jest syntezowany przez polimcrazę termostabilną. Jest obecny tylko jeden starter. Nie maamplifikacji sekwencji tylko w kolejnych cyklach produkt jest syntezowany. Mówimy o tak zwanym PCR asymetrycznym.

Podobnie jak w metodzie Sangera, w sekwencjono-waniu termicznym znajdują się dNTP oraz ddNTP. W metodzie tej zachodząmutacje, ale nie mają one większego znaczenia, gdyż nie są powielane, a mutacje, które nawet powstały są * tłumione’ przez cząsteczki rac zmutowane

Startery używane do sekwencjonowania

•    Starter musi być komplementarny do sekwencjo-nowartej cząsteczki.

•    Starter uniwersalny jest komplementarny do wektora i sekwencjonuje DNA insertu (dowolnego). Wygodna metoda, bo nie znamy DNA insertu, a zatem trudno byłoby znaleźć odpowiedni starter. Jedynym warunkiem jest odpowiednia długość startera.

•    Startery wewnętrzne są używane, gdy dłgość insertu jest zbyt długa. Najpierw używamy startera uniwersalnego. by zbadać część sekwencji, a po jej poznaniu zaczynamy używać ognia, bo trzeba się wykazać niezwykłym wyczuciem w ich projektowaniu. Lepiej używać uniwersalnych.