84759

Jeżeli białko, jakieś regulatorowe, białko, którego oddziaływanie z DNA analizujemy, jeśli takie białko tworzy kompleks z DNA, wtedy DNA zaangażowany w kompleks jest chroniony przed DNazą I. DNaza I nie ma po prostu dostępu do wiązań fosfod i estrowych, które są przesłaniane przez białko oddziałujące z fragmentem DNA. To jest jakby istota tego eksperymentu, w którym występuje DNaza I, w którym wykorzystujemy DNazę I. Eksperyment, o którym mówię był bardzo pobieżnie omawiany w podręczniku Berga, Srajera i nosi on nazwę footprintingu DNazq I. Czyli odcisk stopy ee, e.. otrzymywany przez DNazę w eksperymencie trawienia DNazą I.

Rysunek 2. DNase I footprinting | 1.

Parę słów na temat tego eksperymentu, a w szczególności warunków, w których się go wykonuje, czego nie było mowy w Bergu, Srajerze jak sądzę. E..eksperyment, wykonywany jest w ten sposób, iż na początku DNA musi być jakoś otrzymany. Można go otrzymać metodą PCR lub też po prostu wyciąć fragment z jakiegoś wektora. Taki DNA znakowany jest na końcu. Dla tego eksperymentu właściwym znakowaniem jest jakie znakowanie? Na jednym z 5' końców, albo na 3' końcu, ale musi to być zaznakowany jeden koniec, czyli jak mamy dwa końce cząsteczki typu DS, to tak jak w eksperymencie ochrony przed nukleazą SI tym drugim, który omawiałem musimy mieć zaznakowany tylko jeden koniec DNA. Najprościej jest to uzyskać przy pomocy kinazy T4. Czyli mamy DNA, jak tu jest napisane zaznakowany na końcu i teraz dodajemy białko regulatorowe, które wiąże się z DNA i przeprowadzamy trawienie DNazą. I teraz pierwszy bardzo ważny punkt w tym eksperymencie, otóż trawienie DNazą jest przeprowadzane w takich warunkach, aby DNaza trawiła w każdej z cząsteczek, które występują w roztworze tylko jedno wiązanie fosfodiestrowe. Wróćmy do naszej ilustracji, tutaj mamy pokazaną sytuację następującą; jest białko wiążące DNA, a DNaza jest obecna w takim stężeniu, iż każde wiązanie fosfodiestrowe, które nie jest zaangażowane w kompleks jest trawione. Powstają pojedyncze nukleotydy (Rysunek 1). Tak się nie robi w eksperymencie footprintingu. W tym eksperymencie stężenie DNazy jest tak dobrane, iż jak to pokazała ta ilustracja każda z cząsteczek kompleksu, a więc tego co tworzy DNA i białko, jest trawiona tylko jeden raz, czyli jedno wiązanie fosfodiestrowe. Gdyby było inaczej nie moglibyśmy niczego wnosić na temat tego