6830718889

ENZYMOLOGIA (KP/KR)_

ZAKŁAD BIOCHEMII UMCS

Biochemia i Biotechnologia

2012

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH -1 Ćwicz. 1-2

Podstawy kinetyki reakcji enzymatycznych zostały stwarzane dzięki modelowi kinetycznemu, jaki w 1913 r. zaproponował Leanor Michaelis i Maud Menten do ilościowego opisu reakcji enzymatycznej w oparciu o prowadzane przez nich badania aktywności inwertazy.

Zastosowanie tego właśnie enzymu do badań praktycznych na ćwiczeniach zostało dodatkowo podyktowane zarówno dostępnością enzymu i substratu, jak też stosunkowo niskimi kosztami odczynników.

Inwertaza (sacharaza) według obowiązującej nomenklatury enzymów jest p-D-fruktozydazą (EC 3.2.1.26), należy do klasy hydrolaz rozszczepiających wiązanie p-glikozydawe (glikozydaz - 3.2) w związkach O-glikozylowych (3.2.1). Działanie enzymu polega na hydrolizie końcowych nieredukujących reszt p-D-fruktofuranozydowych. W przypadku sacharozy (a-D-glukopiranozyla-p-D-fruktafuranozy) produktem hydrolizy jest D-ghikoza i D-fruktoza (cukier inwertowany). Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją ze względu na towarzyszącą temu zjawisku zmianę skręcałnaści właściwej z [<x]d= 66,6° na [a]_D= -20°.

Inwertaza jest enzymem rozpowszechnianym w roślinach, jednak najlepszym źródłem otrzymywania jej preparatów są drożdże piwne lub piekarskie, w których występuje ona w najwyższym stężeniu. Inwertaza jest enzymem wewnątrzkomórkowym i do jego ekstrakcji konieczne jest rozbicie błon komórkowych. Istnieje szereg metod otrzymywania i oczyszczania preparatów inwertazy. Do izolacji enzymu można stosować np. autolizę (przez kilka godzin w O, IM NaHC0₃, w temp. 40°C), rozbicie komórek za pomocą homagenizatora ostrzowego łub przez ucieranie drożdży z piaskiem w obecności eteru i ekstrakcję białek wadą

Do oczyszczania inwertazy można wykorzystywać jej małą podatność na strącanie kwasem pikrynowym. Wytrącanie enzymu przeprowadza się też acetonem w niskiej temperaturze (ochrana przed denaturacją).

Zasada oznaczania aktywności inwertazy opiera się na pomiarze stężenia cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) pojawiających się w miarę postępowania enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Roztwór, w którym znajdują się uwolnione podczas hydrolizy monasacharydy gotuje się z odczynnikiem zawierającym miedź dwuwartośriową (mieszanina odczynników Somagyi I i II, w stosunku 4:1). Powstający w wyniku redukcji ceglasty osad CU2O rozpuszcza się następnie w odczynniku Nelsona (arsenomolibdenowym) i uzyskuje roztwór o niebiesko-zielonym zabarwieniu, którego absorbancję odczytuje się przy długości fali 620 nm. Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do stężenia powstałego produktu.

1