7511506861

Ćwiczenie 3. Amplifikacja PCR

W 1983 roku Kaiy Miillis, amerykański biochemik, wynalazł fundamentalną dla biologii molekularnej teclmikę łańcuchowej reakcji polimerazy PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), która zrewolucjonizowała badania genetyczne.

Celem PCR jest wyprodukowanie dużej ilości DNA z próby, zaczynając tylko od śladowej ilości. Te śladowe ilości genomowego DNA np. z pojedynczej cebulki włosowej, kropli krwi, czy uinych płynów ustrojowych wystarczają do syntezy milionów kopii fragmentu DNA. Wynalezienie PCR odegrało bardzo duże rolę w czterech głównych obszarach badań genetycznych: mapowanie genów, klonowanie, sekwencjonowanie DNA i detekcja genów, między innymi w pracach nad genomem człowieka. Obecnie PCR używany jest jako narzędzie diagnostyczne do wykrywalna mutacji, które mogą powodować choroby genetyczne. Wykorzystuje się go również w kryminalistyce oraz medycynie sądowej do identyfikacji na poziomie molekularnym osób podejrzanych o popełnienie przestępstwa. Na dzień dzisiejszy technika ta stosowana jest już na duża skalę w rolnictwie, w hodowli zwierząt i roślin.

Powielenie konkretnego fragmentu DNA wymaga mieszaniny składającej się z następujących odczynników:

1³? sekwencji DNA, która będzie amplifikowana;

³? poszczególnych zasad deoksyrybonukleotydów (A, T, G, C), które są podstawowymi jednostkami budulcowymi DNA;

³? polimerazy Taq - enzymu, który składa nukleotydy w nową molekule DNA;

jonów magnezu - kofaktora potrzebnego polńnerazie do stworzenia nowego łańcucha DNA; starterów - sztucznie syntetyzowanych krótkich fragmentów DNA komplementarnych do matrycy, będących punktem startu dla działania polimerazy;

bufoni - utrzymującego odpowiednie środowisko i pPI dla działania polimerazy i przyłączania starterów.

PCR wykorzystuje te same podstawowe procesy* co komórka organizmu

do skopiowania sw ojego DNA

-    hybrydyzacja komplementarnej nici DNA

-    synteza nici DNA poprzez polimerazę Taq

Do rozpoczęcia procesu amplifikacji niezbędne są statery. Są to specjalnie zaprojektowane ohgonuklotydy, które przyłączają się do końców sekwencji DNA interesującego nas genu i stanowią sygnał dla polimerazy do rozpoczęcia kopiowania DNA. Startery są to dwie krótkie pojedynczej mci DNA (ok. 20-25 nukleotydów). Wyróżniamy dwa typy starterów: starter przedni (ang. forward) - jego sekwencja musi