ÿþP O L I T E C H N I K A ZL S K A
W Y D Z I A A C H E M I C Z N Y
K A T E D R A C H E M I I O R G A N I C Z N E J , B I O O R G A N I C Z N E J
K A T E D R A C H E M I I O R G A N I C Z N E J , B I O O R G A N I C Z N E J
I B I O T E C H N O L O G I I
I B I O T E C H N O L O G I I
W I C Z E N I E 4
O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d
f i l t r a c j i |e l o w e j
L a b o r a t o r i u m z C h e m i i Z w i z k ó w
N a t u r a l n y c h
M i e j s c e w i c z e n i a : s a l a 1 0 2
P r o w a d z c y : d r i n |. I l o n a W A N D Z I K
O p r a c o w a n i e : d r i n |. I l o n a W A N D Z I K
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 2 / 1 1
1 . C e l w i c z e n i a
C e l e m w i c z e n i a j e s t o z n a c z e n i e m a s y c z s t e c z k o w e j ±- a m y l a z y m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j .
w i c z e n i e s k Ba d a s i z d w ó c h z a s a d n i c z y c h c z [c i :
" w y k a l i b r o w a n i a k o l u m n y S e p h a d e x G - 7 5 z a p o m o c m a k r o c z s t e c z e k o z n a n e j m a s i e
c z s t e c z k o w e j ( b Bk i t d e k s t r a n o w y , h e m o g l o b i n a , w i t a m i n a B - 1 2 , c y t o c h r o m C ) .
" u |y c i e w y k a l i b r o w a n e j k o l u m n y d o o z n a c z e n i a m a s y c z s t e c z k o w e j w y b r a n e g o b i a Bk a .
2 . W s t p t e o r e t y c z n y
P o l i p e p t y d y i b i a Bk a
P o l i p e p t y d y i b i a Bk a s p o l i m e r a m i w i e l k o c z s t e c z k o w y m i z Bo |o n y m i z ±- a m i n o k w a s ó w .
P o j e d y n c z e c z s t e c z k i ±- a m i n o k w a s ó w p o Bc z o n e s z e s o b w i z a n i a m i a m i d o w y m i
( p e p t y d o w y m i ) . W i z a n i e p e p t y d o w e p o w s t a j e w t e n s p o s ó b , |e g r u p a a m i n o w a j e d n e g o
a m i n o k w a s u Bc z y s i z g r u p k a r b o k s y l o w d r u g i e g o z w y d z i e l e n i e m c z s t e c z k i w o d y .
H O H O H O H O
N C H C N C H C N C H C N C H C
R R ' R " R
L i c z b p o w i z a n y c h a m i n o k w a s ó w ( d Bu g o [ Ba Dc u c h a ) m o |n a z p e w n y m p r z y b l i |e n i e m
o k r e [l i p r z e z o z n a c z e n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Bk a . P r z y j m u j e s i , |e [r e d n i a m a s a
c z s t e c z k o w a a m i n o k w a s u w y n o s i 1 1 5 D a . P o l i m e r y a m i n o k w a s ó w o m a s i e c z s t e c z k o w e j
d o 1 0 0 0 0 s z a l i c z a n e d o p o l i p e p t y d ó w , n a t o m i a s t p o l i m e r y o m a s i e c z s t e c z k o w e j
p r z e k r a c z a j c e j t w a r t o [ z a l i c z a s i d o b i a Be k . M a s c z s t e c z k o w b i a Be k i i n n y c h
m a k r o c z s t e c z e k p o z a m e t o d s p e k t r o m e t r i i m a s o w e j m o |n a o z n a c z y m . i n . : m e t o d
s e d y m e n t a c j i w u l t r a w i r o w a n i u , m e t o d e l e k t r o f o r e z y l u b f i l t r a c j i |e l o w e j . M a s y
c z s t e c z k o w e b i a Be k w a h a j s i w g r a n i c a c h o d o k . 1 1 , 5 k D a d o w i e l u m i l i o n ó w D a l t o n ó w .
P r z y k Ba d o w e m a s y c z s t e c z k o w e b i a Be k n a j c z [c i e j s t o s o w a n y c h j a k o m a r k e r y m a s y
c z s t e c z k o w e j p r z e d s t a w i a T a b e l a 1 .
T a b e l a 1 . M a s y c z s t e c z k o w e b i a Be k m a r k e r ó w .
B i a Bk o M a s a c z s t e c z k o w a ( D a )
1 4 2 0 0
±- l a c t a l b u m i n z m l e k a k r o w i e g o
L i z o z y m z j a j a k u r z e g o 1 4 3 0 0
M i o g l o b i n a 1 5 0 0 0
I n h i b i t o r t r y p s y n y z s o i 2 0 1 0 0
A n h y d r a z a w g l a n o w a 2 9 0 0 0
A l b u m i n a j a j a k u r z e g o 4 5 0 0 0
5 3 0 0 0
±- a m y l a z a z B a c i l l u s s p e c i e s
H e m o g l o b i n a 6 8 0 0 0
A l b u m i n a s u r o w i c y w o Bo w e j 6 7 0 0 0
F o s f o r y l a z a B z m i [n i k r ó l i k a 9 4 0 0 0
1 1 6 0 0 0
²- g a l a k t o z y d a z a z E s c h e r i c h i a c o l i
M i o z y n a z m i [n i k r ó l i k a 2 0 5 0 0 0
B l u e D e x t r a n 2 0 0 0 0 0 0
C y t o c h r o m C 1 2 4 0 0
W i t a m i n a B - 1 2 1 3 5 5
B Bk i t t y m o l o w y 4 8 3
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 3 / 1 1
I s t n i e j e k i l k a s p o s o b ó w k l a s y f i k a c j i b i a Be k , z k t ó r y c h n a j b a r d z i e j r o z p o w s z e c h n i o n y d z i e l i
b i a Bk a z e w z g l d u n a b u d o w n a b i a Bk a p r o s t e i z Bo |o n e . B i a Bk a p r o s t e z b u d o w a n e s z
Ba Dc u c h ó w p o l i p e p t y d o w y c h , k t ó r e p o h y d r o l i z i e d a j w y Bc z n i e a m i n o k w a s y l u b i c h
p o c h o d n e . B i a Bk a z Bo |o n e s k Ba d a j s i z c z s t e c z k i b i a Bk a p r o s t e g o p o Bc z o n e g o z i n n ,
n i e b i a Bk o w c z s t e c z k , z w y k l e o r g a n i c z n ( t z w . g r u p p r o s t e t y c z n ) z u d z i a Be m w i z a D
k o w a l e n c y j n y c h , j o n o w y c h i k o o r d y n a c y j n y c h .
Z e w z g l d u n a k s z t a Bt c z s t e c z k i , w y r ó |n i a s i b i a Bk a w Bó k n i s t e ( f i b r y l a r n e ) i k Bb u s z k o w e
( g l o b u l a r n e ) . B i a Bk a f i b r y l a r n e s p o d s t a w o w y m i e l e m e n t a m i b u d o w y t k a n e k z w i e r z c y c h ,
c h a r a k t e r y z u j s i z n a c z n a s y m e t r i c z s t e c z e k , t j . d u |y m s t o s u n k i e m d Bu g o [c i o s i d Bu g i e j
d o k r ó t k i e j . B i a Bk a m i g l o b u l a r n y m i s e n z y m y , p r z e c i w c i a Ba i n i e k t ó r e h o r m o n y . B i a Bk a
g l o b u l a r n e m a j k s z t a Bt e l i p t y c z n y i z a z w y c z a j d o b r z e r o z p u s z c z a j s i w w o d z i e .
B i a Bk a m o |n a o c z y s z c z a w f o r m i e a k t y w n e j w y k o r z y s t u j c i c h w Ba [c i w o [c i
f i z y k o c h e m i c z n e , t a k i e j a k :
" w i e l k o [,
" Ba d u n e k ,
" r o z p u s z c z a l n o [,
" s p e c y f i c z n e p o w i n o w a c t w o w i z a n i a d o i n n y c h c z s t e c z e k .
T e c h n i k w y k o r z y s t y w a n d o r o z d z i a Bu m a k r o c z s t e c z e k j e s t c h r o m a t o g r a f i a . G Bó w n i e
s t o s o w a n e t y p y c h r o m a t o g r a f i i t o :
" f i l t r a c j a |e l o w a ; r o z d z i a B n a s t p u j e z u w a g i n a r o z m i a r c z s t e c z e k ,
" c h r o m a t o g r a f i a j o n o w y m i e n n a ; w y k o r z y s t u j e s i r ó |n i c e w Ba d u n k u w y p a d k o w y m
o d m i e n n y c h c z s t e c z e k b i a Bk o w y c h
" c h r o m a t o g r a f i a p o w i n o w a c t w a ; w y k o r z y s t u j e s i p o w i n o w a c t w o b i a Be k d o
s p e c y f i c z n y c h g r u p c h e m i c z n y c h ,
" w y s o k o c i [n i e n i o w a c h r o m a t o g r a f i a c i e c z o w a ; u s p r a w n i a w c z e [n i e j w y m i e n i o n e
m e t o d y c h r o m a t o g r a f i c z n e .
P r z e d m i o t e m w i c z e n i a j e s t o z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j M C Z b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i
|e l o w e j , d l a t e g o t y l k o t a t e c h n i k a z o s t a n i e o m ó w i o n a w i n s t r u k c j i .
C h r o m a t o g r a f i a m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j .
F i l t r a c j a |e l o w a , i n a c z e j c h r o m a t o g r a f i a r o z m i a r ó w w y k l u c z a j c y c h j e s t t e c h n i k m a j c
z a s t o s o w a n i e p r e p a r a t y w n e d o o c z y s z c z a n i a b i a Be k l u b i n n y c h m a k r o c z s t e c z e k . P o n a d t o z a
p o m o c f i l t r a c j i |e l o w e j m o |n a o z n a c z a m a s c z s t e c z k o w b i a Be k i i n n y c h b i o p o l i m e r ó w .
W f i l t r a c j i |e l o w e j :
" K r y t e r i u m r o z d z i a Bu m a k r o c z s t e c z e k j e s t i c h w i e l k o [.
" W i k s z e c z s t e c z k i w y m y w a n e s z k o l u m n y j a k o p i e r w s z e .
" M n i e j s z e c z s t e c z k i w y m y w a n e s z k o l u m n y j a k o o s t a t n i e .
D l a c z e g o m a k r o c z s t e c z k i o r ó |n y c h M C Z w y m y w a n e s z r ó |n s z y b k o [c i ?
Z a s a d a s e p a r a c j i p r z e d s t a w i o n a n a R y s u n k u 1 o p a r t a j e s t n a w y k o r z y s t a n i u p o r o w a t o [c i
w y p e Bn i e n i a k o l u m n y . W y p e Bn i e n i e t a k i e z a w i e r a l i c z n e m i k r o s k o p i j n e k a n a l i k i l u b p o r y o
p o w t a r z a l n e j w i e l k o [c i . P o n a n i e s i e n i u n a k o l u m n r o z d z i e l a n y c h s u b s t a n c j i , n a s t p u j e
w y m y w a n i e p o s z c z e g ó l n y c h s k Ba d n i k ó w m i e s z a n i n y z a p o m o c b u f o r u w y m y w a j c e g o .
W z g l d n i e m a Be c z s t e c z k i m o g p r z e m i e s z c z a s i p o m i d z y z i a r n a m i z Bo |a l u b w n i k a d o
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 4 / 1 1
w e w n t r z p o r ó w . Z k o l e i w i k s z e c z s t e c z k i m o g t y l k o p r z e m i e s z c z a s i p o m i d z y
z i a r n a m i z Bo |a . J e [l i j a k a [ c z s t e c z k a w n i k n i e w g Bb p o r a j e j p r z e m i e s z c z a n i e w d ó B
k o l u m n y z o s t a j e s p o w o l n i o n e , g d y | p r z e p By w b u f o r u w y m y w a j c e g o w e w n t r z z i a r e n j e s t
d u |o w o l n i e j s z y n i | n a z e w n t r z . A z a t e m c z s t e c z k i z n a j d u j c e s i w m i e s z a n i n i e u l e g a j
p o d z i a Bo w i p o m i d z y f a z y V O ( p o z a z i a r n a m i z Bo |a ) i V I ( w e w n t r z z i a r e n z Bo |a , w p o r a c h
|e l u ) .
P r ó b k a b i a Bk a
Z i a r n o z Bo |a
M a Be c z s t e c z k i z a t r z y m y w a n e
s w p o r a c h z i a r e n
M a Be c z s t e c z k i w y m y w a n e
j a k o o s t a t n i e
D u |e c z s t e c z k i w y m y w a n e
j a k o p i e r w s z e
R y s u n e k 1 . C h r o m a t o g r a f i a n a d r o d z e f i l t r a c j i |e l o w e j
P o d s t a w o w e o z n a c z e n i a :
V E O b j t o [ e l u c j i
V O O b j t o [ s w o b o d n a ( m a r t w a ) , c z y l i o b j t o [ c i e c z y z a l e g a j c e j m i d z y z i a r e n k a m i |e l u
V T O b j t o [ c a Bk o w i t a
V M O b j t o [ s a m e g o |e l u
V I O b j t o [ w e w n t r z n a , o b j t o [ c i e c z y z a w a r t e j w p o r a c h |e l u
E l u e n t r o z p u s z c z a l n i k s t o s o w a n y d o w y m y w a n i a ( e l u c j i ) s k Ba d n i k ó w m i e s z a n i n y z
k o l u m n y c h r o m a t o g r a f i c z n e j
E l u a t - r o z t w ó r w y p By w a j c y z k o l u m n y c h r o m a t o g r a f i c z n e j , e l u e n t w r a z z r o z p u s z c z o n y m i
w n i m s k Ba d n i k a m i r o z d z i e l a n e j c h r o m a t o g r a f i c z n i e m i e s z a n i n y .
O b j t o [ c i e c z y p o z a z Bo |e m n a z y w a n a j e s t o b j t o [c i s w o b o d n i o z n a c z a n a V O . O b j t o [
s w o b o d n V O m o |n a w y z n a c z y p r z e p u s z c z a j c p r z e z k o l u m n s u b s t a n c j b a r w n o b a r d z o
d u |e j m a s i e c z s t e c z k o w e j , k t ó r a w o g ó l e n i e w n i k n i e d o p o r ó w . N a j c z [c i e j s t o s u j e s i
b Bk i t d e k s t r a n o w y , p o l i s a c h a r y d o m a s i e c z s t e c z k o w e j r z d u 2 * 1 0 6 D a . M i e r z y s i i l o [
w y c i e k u o d c h w i l i n a n i e s i e n i a p r ó b k i d o m o m e n t u j e j w y j [c i a z k o l u m n y . Z k o l e i V I m o |n a
w y z n a c z y , p r z e p u s z c z a j c p r z e z k o l u m n s u b s t a n c j b a r w n o b a r d z o m a Be j m a s i e
c z s t e c z k o w e j . C a Bk o w i t o b j t o [ u t w o r z o n e g o w y p e Bn i e n i a m o |n a o k r e [l i w z o r e m :
V T = V O + V I + V M
g d z i e V M o z n a c z a o b j t o [ s a m e g o |e l u , k t ó r j a k o z n a c z n i e m n i e j s z o d p o z o s t a By c h p o m i j a
s i .
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 5 / 1 1
W y z n a c z a n i e o b j t o [c i e l u c j i V E s k Ba d n i k ó w m i e s z a n i n y
Z a z w y c z a j w y c i e k z k o l u m n y z b i e r a n y j e s t w p o s t a c i f r a k c j i o o k r e [l o n e j o b j t o [c i . W
w i k s z o [c i p r z y p a d k ó w w y m y w a n e m a k r o c z s t e c z k i n i e s b a r w n e , a z a t e m z a c h o d z i
k o n i e c z n o [ o z n a c z e n i a , k t ó r e f r a k c j e z a w i e r a j b i a Bk o i w j a k i e j i l o [c i . O z n a c z e n i a t a k i e g o
n a l e |y d o k o n a z a p o m o c i n n y c h t e c h n i k , j a k n p . a n a l i z a s p e k t r o f o t o m e t r y c z n a f r a k c j i ,
e l e k t r o f o r e z a w w a r u n k a c h d e n a t u r u j c y c h l u b p o m i a r a k t y w n o [c i e n z y m a t y c z n e j
p o s z c z e g ó l n y c h f r a k c j i ( g d y o z n a c z a n e b i a Bk o j e s t e n z y m e m i z n a n y j e s t j e g o s u b s t r a t ) . W
p r z y p a d k u s u b s t a n c j i b a r w n y c h j a k o V E m o |n a p r z y j [r o d k o w w a r t o [ o b j t o [c i p o m i d z y
p i e r w s z i o s t a t n i z e b r a n k r o p l b a r w n e g o w y c i e k u z k o l u m n y . O z n a c z o n e s t |e n i a
m a k r o c z s t e c z e k p r z e d s t a w i a s i w f u n k c j i o b j t o [c i e l u c j i ( R y s u n e k 2 )
S t |e n i e
V E
R y s u n e k 2 . S t |e n i e p o s z c z e g ó l n y c h s k Ba d n i k ó w w f u n k c j i o b j t o [c i e l u c j i
P o d c z a s f i l t r a c j i p r ó b k i z Bo |o n e j z k i l k u s k Ba d n i k ó w o z r ó |n i c o w a n y c h w i e l k o [c i a c h , d u |e
c z s t e c z k i b d s p o r a d y c z n i e w n i k a By d o p o r ó w , a l e z o s t a n w y m y t e z k o l u m n y p ó zn i e j w
s t o s u n k u d o b Bk i t u d e k s t r a n o w e g o . Z k o l e i m a Be c z s t e c z k i , k t ó r e b d r e g u l a r n i e w n i k a By d o
p o r ó w |e l u o p u s z c z k o l u m n j a k o o s t a t n i e . I m m n i e j s z a c z s t e c z k a t y m Ba t w i e j b d z i e
z a t r z y m y w a n a n a |e l u . A z a t e m r o z m i a r c z s t e c z e k d e c y d u j e o o b j t o [c i e l u c j i d a n e j
s u b s t a n c j i V E . R o z m i a r g e o m e t r y c z n y c z s t e c z k i s k o r e l o w a n y j e s t z m a s c z s t e c z k o w .
D o [w i a d c z a l n i e w y z n a c z o n o z a l e |n o [ m a s y c z s t e c z k o w e j w f u n k c j i o b j t o [c i e l u c j i V E . W
p e w n y m z a k r e s i e m a s c z s t e c z k o w y c h o t r z y m u j e s i w y k r e s l i n i o w y :
l o g M C Z = a + b * V E / V O
7
6
5
4
3
2
1
0
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
w z g l d n a o b j t o [ e l u c j i V e / V o
R y s u n e k 3 . Z a l e |n o [ m a s y c z s t e c z k o w e j o d o b j t o [c i e l u c j i
l o g M c z
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 6 / 1 1
O b j t o [ e l u c j i j e s t o d w r o t n i e p r o p o r c j o n a l n a d o l o g a r y t m u z M C Z . M o |n a s p o r z d z i k r z y w
w z o r c o w d l a b i a Be k o z n a n e j m a s i e c z s t e c z k o w e j m a r k e r ó w , a n a s t p n i e p o w y z n a c z e n i u
w s p ó Bc z y n n i k ó w a i b c h a r a k t e r y s t y c z n y c h d l a d a n e g o w y p e Bn i e n i a w y z n a c z y m a s
c z s t e c z k o w n i e z n a n e g o b i a Bk a ( R y s u n e k 3 ) .
N a r y n k u i s t n i e j e w i e l e w y p e Bn i e D k o l u m n o w y c h d o p r z e p r o w a d z e n i a f i l t r a c j i |e l o w e j . S t o
w y p e Bn i a c z e w g l o w o d a n o w e ( d e x t r a n , a g a r o z a ) l u b p o l i a k r y l o a m i d o w e . N a j c z [c i e j
s t o s o w a n y m i |e l a m i d o t e j c h r o m a t o g r a f i i s p r e p a r a t y o n a z w a c h h a n d l o w y c h : S e p h a d e x ,
S e p h a r o s e i B i o g e l .
W y b ó r w y p e Bn i e n i a z a l e |y o d w i e l k o [c i c z s t e c z e k , k t ó r e b d r o z d z i e l a n e w p r o c e s i e
f i l t r a c j i . Z e s t a w i e n i e k i l k u p r z y k Ba d o w y c h w y p e Bn i e D t y p u d e k s t r a n o w e g o i i c h
c h a r a k t e r y s t y k p r z e d s t a w i a T a b e l a 2 . W y p e Bn i e n i e n a n o s z o n e n a k o l u m n w z a w i e s i n i e w
b u f o r z e p r z y p o m i n a |e l , s t d n a z w a f i l t r a c j a |e l o w a . D o p r z y g o t o w a n i a z a w i e s i n y w b u f o r z e
n i e n a l e |y u |y w a m i e s z a d e B m a g n e t y c z n y c h , g d y | t o m o |e s p o w o d o w a f r a g m e n t a c j z Bo |a .
P r z e d n a Bo |e n i e m |e l u n a k o l u m n n a l e |y |e l s p c z n i ( c z a s p c z n i e n i a 2 4 h w p r z y p a d k u
S e p h a d e x u G - 7 5 ) . P o n a Bo |e n i u |e l u n a k o l u m n n a l e |y s p r a w d z i u p a k o w a n i e |e l u . G d y |e l
j e s t p r a w i d Bo w o u Bo |o n y , s u b s t a n c j a b a r w n a , n a p r z y k Ba d b Bk i t d e k s t r a n o w y w y p By w a w
p o s t a c i r e g u l a r n e g o n i e r o z m y t e g o p a s m a . O b j t o [ p r ó b k i n a n o s z o n e j w p r z y p a d k u
f r a k c j o n o w a n i a p o w i n n a w y n o s i o k o Bo 2 % o b j t o [c i c a Bk o w i t e j k o l u m n y .
T a b e l a 2 . C h a r a k t e r y s t y k a w y p e Bn i e D d o f i l t r a c j i |e l o w e j .
P r z y b l i |o n a o b j t o [
N a z w a Z a k r e s M C Z ( D a ) u t w o r z o n e g o w y p e Bn i e n i a
( m l / g )
S e p h a d e x G - 1 5 < 1 5 0 0 2 - 3
S e p h a d e x G - 2 5 1 0 0 0 - 5 0 0 0 4 - 6
S e p h a d e x G - 5 0 1 5 0 0 - 3 0 0 0 0 9 - 1 5
S e p h a d e x G - 7 5 3 0 0 0 - 8 0 0 0 0 1 2 - 1 5
S e p h a d e x G - 1 0 0 4 0 0 0 - 1 5 0 0 0 0 1 5 - 2 0
S e p h a d e x G - 1 5 0 5 0 0 0 - 3 0 0 0 0 0 2 0 - 3 0
S e p h a d e x G - 2 0 0 5 0 0 0 - 6 0 0 0 0 0 3 0 - 4 0
S e p h a d e x D e k s t r a n p o p r z e c z n i e s i e c i o w a n y z e p i c h l o r o h y d r y n w w a r u n k a c h a l k a l i c z n y c h
T e s t n a o b e c n o [ a m y l a z y
±- A m y l a z a j e s t e n z y m e m t r a w i e n n y m , k a t a l i z u j c y m r o z k Ba d s k r o b i . S k r o b i a j e s t p o l i m e r e m
c u k r o w y m z Bo |o n y m z j e d n o s t e k D - g l u k o z y p o Bc z o n y c h w i z a n i a m i g l i k o z y d o w y m i . W
w y n i k u r e a k c j i k a t a l i t y c z n e j w i z a n i a g l i k o z y d o w e s k r o b i u l e g a j h y d r o l i z i e i z w i k s z a s i
z a w a r t o [ j e d n o s t e k s k Ba d a j c y c h s i z k r ó t k i c h Ba Dc u c h ó w o l i g o s a c h a r y d o w y c h , d w u c u k r ó w
( m a l t o z y ) i c u k r ó w p r o s t y c h ( g l u k o z y ) . P r z e b i e g t e j r e a k c j i m o |n a [l e d z i u |y w a j c r o z t w o r u
j o d u w j o d k u p o t a s u . J o d t w o r z y z j e d n y m z e s k Ba d n i k ó w s k r o b i , a m y l o z , k o m p l e k s y
i n k l u z y j n e o i n t e n s y w n y m , c i e m n o n i e b i e s k i m z a b a r w i e n i u ( a m y l o z a - s u b s t r a t ±- a m y l a z y ) .
K o l o r r o z t w o r u z a l e |y o d s t o p n i a h y d r o l i z y w i z a n i a g l i k o z y d o w e g o w a m y l o z i e . I m w i c e j
±- a m y l a z y , t y m m n i e j s k r o b i i w r o z t w o r z e , a w z w i z k u z t y m j a [n i e j s z y k o l o r r o z t w o r u . W
m o m e n c i e , g d y s k r o b i a z o s t a n i e z h y d r o l i z o w a n a d o j e d n o s t e k z a w i e r a j c y c h m n i e j n i | 6
j e d n o s t e k D - g l u k o z y n a s t p u j e c a Bk o w i t e o d b a r w i e n i e r o z t w o r u .
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 7 / 1 1
P r z y k Ba d o w e p y t a n i a k o n t r o l n e :
N a c z y m o p a r t a j e s t z a s a d a s e p a r a c j i s u b s t a n c j i w f i l t r a c j i |e l o w e j ?
D o j a k i c h c e l ó w m a z a s t o s o w a n i e f i l t r a c j a |e l o w a ?
W d o [w i a d c z e n i u p r z y j t o z a Bo |e n i e d o t y c z c e k s z t a Bt u c z s t e c z k i , j a k i e ?
O b j t o [ e l u c j i w r a z z e w z r o s t e m m a s y c z s t e c z k o w e j s u b s t a n c j i b d z i e s i z w i k s z a Ba c z y
z m n i e j s z a Ba ?
G d y b y c z s t e c z k i p o d c z a s s e p a r a c j i o d d z i a By w a By z w y p e Bn i e n i e m t o o d c z y t a n a z w y k r e s u
m a s a c z s t e c z k o w a b d z i e z a w y |o n a c z y z a n i |o n a ?
N i e s f e r y c z n e , p o d Bu |n e c z s t e c z k i b d u l e g a By w y m y w a n i u s z y b c i e j c z y w o l n i e j o d
s f e r y c z n y c h ?
D l a c z e g o o b j t o [ e l u c j i p r z e d s t a w i o n a j e s t n a w y k r e s i e j a k o w a r t o [ w z g l d n a V E / V O ?
N a c z y m p o l e g a t e s t n a o b e c n o [ ±- a m y l a z y ?
O p i s z b u d o w b i a Be k .
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 8 / 1 1
3 . W y k o n a n i e w i c z e n i a
M a t e r i a By i s p r z t
K o l u m n a S e p h a d e x G - 7 5 o w y m i a r a c h 1 c m x 3 0 c m
S t a t y w y n a p r o b ó w k i w i r ó w k o w e
S t a t y w y n a p r o b ó w k i s z k l a n e
P r o b ó w k i w i r ó w k o w e p o j e m n o [c i 2 m l
P r o b ó w k i s z k l a n e
P i p e t a P 1 0 0 0 ( n i e b i e s k i e k o Dc ó w k i )
P i p e t a P 2 0 0 ( |ó Bt e k o Dc ó w k i )
K o Dc ó w k i d o p i p e t
C y l i n d e r m i a r o w y p o j e m n o [c i 5 0 m l
Aa zn i a w o d n a 4 5 O C
S p e k t r o f o t o m e t r U V
O d c z y n n i k i
B u f o r f o s f o r a n o w y p H 6 . 6
M i e s z a n i n a w z o r c o w a d o s e p a r a c j i : 0 . 6 m g b Bk i t u d e k s t r a n o w e g o , 1 . 0 m g h e m o g l o b i n y , 0 . 1 5
m g b Bk i t u t y m o l o w e g o w 0 . 5 m l b u f o r u f o s f o r a n o w e g o
u |y w a n e g o d o e l u c j i
R o z t w ó r n i e z n a n e j ±- a m y l a z y w 0 . 5 m l b u f o r u e l u c y j n e g o
T e s t n a o b e c n o [ ±- a m y l a z y : 0 . 2 % r o z t w ó r s k r o b i i
1 M r o z t w ó r H C l
o d c z y n n i k L u g o l a
1 . D o d w ó c h m a By c h s t a t y w ó w p r z y g o t u j p o 1 5 p o n u m e r o w a n y c h m i k r o p r o b ó w e k
w i r ó w k o w y c h o p o j e m n o [c i 2 m l d o z b i e r a n i a w y c i e k u z k o l u m n y ( s e r i a c z a r n a l u b
c z e r w o n a ) .
2 . O t w ó r z k r a n i k w y l o t o w y z k o l u m n y i u s u D b u f o r f o s f o r a n o w y d o z l e w k i t a k , a b y p o z i o m
c i e c z y z n a j d o w a B s i 0 . 5 c m p o w y |e j g ó r n e j g r a n i c y z Bo |a .
3 . N a n o s z e n i e p r ó b k i . B a r d z o d e l i k a t n i e w p r o w a d z k o Dc ó w k p i p e t y a u t o m a t y c z n e j P 1 0 0 0
( n i e b i e s k i e k o Dc ó w k i ) n i e c o p o n i |e j p o z i o m u c i e c z y i z a d o z u j 0 . 5 m l m i e s z a n i n y
w z o r c o w e j d o s t a r c z o n e j p r z e z p r o w a d z c e g o .
4 . E l u c j a . U m i e [ p i e r w s z y o d b i e r a l n i k u w y l o t u k o l u m n y , o t w ó r z k r a n i k w y l o t o w y i
z b i e r a j f r a k c j e o p o j e m n o [c i 2 m l ( g ó r n a k r e s k a n a p r o b ó w c e ) . G d y s t r e f a p r ó b k i w n i k n i e
c a Bk o w i c i e w z Bo |e d o d a j o s t r o |n i e z a p o m o c p i p e t y d o d a t k o w p o r c j b u f o r u
f o s f o r a n o w e g o p H 6 . 6 . K o l e j n p o r c j d o d a j z c y l i n d r a ( r a z e m o k o Bo 3 0 m l b u f o r u ) .
U w a g a : p o d c z a s d o l e w a n i a b u f o r u i n a n o s z e n i a p r ó b k i u w a |a j , a b y n i e n a r u s z y
p o w i e r z c h n i |e l u . N i g d y n i e p o z w ó l , a b y p o z i o m c i e c z y s p a d B p o n i |e j g ó r n e j g r a n i c y
z Bo |a .
5 . G d y w s z y s t k i e b a r w n e s k Ba d n i k i z o s t a n w y m y t e z k o l u m n y p r z e m y j k o l u m n d o d a t k o w
p o r c j b u f o r u ( 5 - 1 0 m l ) . Z a k r k u r e k w y l o t o w y , g d y p o z i o m c i e c z y b d z i e z n a j d o w a B s i
1 c m p o w y |e j g ó r n e j g r a n i c y z Bo |a .
6 . A n a l i z a s p e k t r o f o t o m e t r y c z n a f r a k c j i .
Z a w a r t o [ b a r w n y c h w y c i e k ó w p r z e n i e [ b e z p o [r e d n i o d o k u w e t y p o m i a r o w e j P r z e d
p o m i a r e m a b s o r b a n c j i d o k u w e t y d o d a j d o k Ba d n i e 1 m l b u f o r u f o s f o r a n o w e g o p H 6 . 6 .
P a m i t a j , a b y p r z e d k a |d s e r i w y z e r o w a a p a r a t u m i e s z c z a j c w k o m o r z e r o z t w ó r
o d n o [n i k o w y : b u f o r f o s f o r a n o w y p H 6 . 6 .
D o k o n a j p o m i a r u a b s o r b a n c j i p r z y n a s t p u j c y c h d Bu g o [c i a c h f a l :
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 9 / 1 1
b Bk i t d e k s t r a n o w y : » = 6 5 0 n m ( U w a g a : j e [l i f r a k c j a b Bk i t u d e k s t r a n o w e g o b d z i e
z a w a r t a w j e d n y m o d b i e r a l n i k u t o n i e w y k o n u j e s i
o z n a c z e n i a s p e k t r o f o t o m e t r y c z n e g o ) .
h e m o g l o b i n a : » = 4 6 2 n m
w i t a m i n a B - 1 2 : » = 3 8 0 n m
b Bk i t t y m o l o w y : » = 5 2 0 n m
7 . N a n o s z e n i e p r ó b k i n i e z n a n e j ±- a m y l a z y . N a n i e [ 0 . 5 m l r o z t w o r u z a w i e r a j c e g o
±
±±
n i e z n a n e b i a Bk o , d o s t a r c z o n e g o p r z e z p r o w a d z c e g o . P r z e p r o w a d z e l u c j b u f o r e m
f o s f o r a n o w y m p H 6 . 6 , z b i e r a j c 2 m l f r a k c j e d o m i k r o p r o b ó w e k w i r ó w k o w y c h . P o
z e b r a n i u f r a k c j i o d p o w i a d a j c e j o b j t o [c i e l u c j i s k Ba d n i k a o n a j m n i e j s z e j m a s i e
c z s t e c z k o w e j z p o p r z e d n i e g o d o [w i a d c z e n i a z a k o Dc z e l u c j . W y k o n a j t e s t n a o b e c n o [
±- a m y l a z y . W y z n a c z o b j t o [ e l u c j i o d p o w i a d a j c f r a k c j i o m a k s y m a l n y m s t |e n i u
b i a Bk a .
T e s t n a o b e c n o [ ±
±- a m y l a z y :
±±
P r z y g o t u j w s t a t y w i e p o n u m e r o w a n e p r o b ó w k i s z k l a n e ( o d p o w i e d n i o s e r i a c z a r n a i
c z e r w o n a ) . N u m e r p r o b ó w k i s z k l a n e j o d p o w i a d a n u m e r o w i f r a k c j i w y c i e k u z k o l u m n y .
D o k a |d e j p r o b ó w k i d o d a j 1 m l 0 . 2 % r o z t w o r u s k r o b i i o r a z 1 m l b u f o r u f o s f o r a n o w e g o
p H 6 . 6 . z a p o m o c p i p e t y P 1 0 0 0 ( n i e b i e s k i e k o Dc ó w k i ) . N a s t p n i e w p r o w a d z 5 0 µ l
k a |d e j f r a k c j i z e b r a n e j z k o l u m n y . D o o d m i e r z a n i a 5 0 µ l ( 0 . 0 5 m l ) u |y j p i p e t y P 2 0 0
( |ó Bt e k o Dc ó w k i ) . S t a t y w z p r o b ó w k a m i s z k l a n y m i u m i e [ w Ba zn i w o d n e j o t e m p e r a t u r z e
4 5 O C i t e r m o s t a t u j 5 m i n u t . W z l e w c e p r z y g o t u j 2 0 m l o d c z y n n i k a L u g o l a z 1 M k w a s e m
s o l n y m ( 1 : 1 , v : v ) . W y j m i j s t a t y w z p r o b ó w k a m i n a b i b u B i s z y b k o d o d a j d o w s z y s t k i c h
p r o b ó w e k p o 1 m l z a k w a s z o n e g o o d c z y n n i k a L u g o l a .
W i z u a l n i e o z n a c z f r a k c j e z a w i e r a j c e ±- a m y l a z . T e s t p o z y t y w n y : o d b a r w i e n i e
c i e m n o n i e b i e s k i e g o r o z t w o r u . T e s t n e g a t y w n y : c i e m n o n i e b i e s k i e z a b a r w i e n i e r o z t w o r u .
N a s p e k t r o f o t o m e t r z e C e c i l d o k o n a j p o m i a r u a b s o r b a n c j i p r z y d Bu g o [c i f a l i »= 6 1 0 n m .
O z n a c z e n i e w y k o n a j t y l k o d l a f r a k c j i z a w i e r a j c y c h ±- a m y l a z ( r o z t w o r y o r ó |n y m
s t o p n i u o d b a r w i e n i a r o z t w o r u ) . Z a w a r t o [ p r o b ó w e k p r z e n i e [ b e z p o [r e d n i o d o k u w e t y .
P a m i t a j , a b y n a j p i e r w w y z e r o w a a p a r a t u m i e s z c z a j c w k o m o r z e r o z t w ó r
o d n o [n i k o w y : b u f o r f o s f o r a n o w y p H 6 . 6 .
U w a g a : d o p Bu k a n i a c y l i n d r ó w m i a r o w y c h , p r o b ó w e k z a w s z e u |y w a j w o d y
d e s t y l o w a n e j .
8 . P o z a k o Dc z e n i u d o [w i a d c z e n i a k o l u m n p r z e m y j b u f o r e m f o s f o r a n o w y m p H 6 . 6 ( u |y j
o k o Bo 2 5 m l b u f o r u ) . W s z y s t k i e p r o b ó w k i u m y j d o k Ba d n i e p r z y u |y c i u s z c z o t e c z e k i
p r z e m y j w o d d e s t y l o w a n . O p i s o z n a c z a j c y n u m e r p r o b ó w k i s z k l a n e j z m y j a c e t o n e m
( n i e u s u w a j n u m e r ó w z m i k r o p r o b ó w e k w i r ó w k o w y c h ) . R o z t w o r y p o a n a l i z a c h o r a z
w y c i e k z k o l u m n y w y l e j d o z l e w u .
9 . W y n i k i z a n o t u j w k a r c i e p r a c y . N a p a p i e r z e m i l i m e t r o w y m s p o r z d z w y k r e s a b s o r b a n c j i
k a |d e j a n a l i z o w a n e j f r a k c j i w f u n k c j i n u m e r u p o r z d k o w e g o f r a k c j i . W y k r e s w y k o n a j d l a
t r z e c h c y k l i j e d n o c z e [n i e . Z a z n a c z d Bu g o [ f a l , p r z y k t ó r y c h d o k o n y w a n o p o m i a r u .
W y z n a c z m a k s i m u m k a |d e g o p i k u i o d c z y t a j o d p o w i a d a j c m u o b j t o [ e l u c j i
( p a m i t a j : k a |d a f r a k c j a z a w i e r a 2 m l ) .
1 0 . S p o r z d z w y k r e s l o g M c z w f u n k c j i V E / V O d l a m i e s z a n i n y w z o r c o w e j . O d c z y t a j l o g M c z d l a
n i e z n a n e g o b i a Bk a i o b l i c z j e g o m a s c z s t e c z k o w .
1 1 . W y z n a c z e n i e o b j t o [c i w y p e Bn i e n i a . D o p u s t e j k o l u m n y o t a k i c h s a m y c h w y m i a r a c h j a k
u |y t a w d o [w i a d c z e n i u w l e j i l o [ w o d y o d p o w i a d a j c e j p o z i o m o w i w y p e Bn i e n i a .
N a s t p n i e z m i e r z o b j t o [ w o d y w c y l i n d r z e m i a r o w y m .
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 1 0 / 1 1
1 2 . W y z n a c z e n i e o b j t o [c i c a Bk o w i t e j V T . P r z y j m u j c z a V I o b j t o [ e l u c j i s k Ba d n i k a
w y m y w a n e g o j a k o o s t a t n i e g o o b l i c z o b j t o [ c a Bk o w i t u t w o r z o n e g o w y p e Bn i e n i a V T z e
w z o r u :
V T = V O + V I + V M
U w a g a : p r z y j m i j , |e o b j t o [ s a m e g o |e l u V M H"0 . 2 5 m l .
W a r u n k i z a l i c z e n i a w i c z e n i a :
" P o z y t y w n y w y n i k k a r t k ó w k i d o p u s z c z a j c e j d o w y k o n a n i a w i c z e n i a
" W y k o n a n i e s p r a w o z d a n i a w t e r m i n i e d o d w ó c h t y g o d n i . S p r a w o z d a n i e p o w i n n o
z a w i e r a d w a w y k r e s y n a p a p i e r z e m i l i m e t r o w y m : z a l e |n o [ a b s o r b a n c j i w f u n k c j i
n u m e r u p o r z d k o w e g o f r a k c j i o r a z k r z y w w z o r c o w ( w y k r e s l o g M C Z w f u n k c j i
V E / V O ) . Z k r z y w e j w z o r c o w e j o d c z y t a j m a s c z s t e c z k o w n i e z n a n e j ±- a m y l a z y .
P o n a d t o n a l e |y o b l i c z y o b j t o [ c a Bk o w i t w y p e Bn i e n i a . D o s p r a w o z d a n i a n a l e |y
d o Bc z y k a r t p r a c y .
Z a l e c a n a l i t e r a t u r a :
J . M . B e r g , J . L . T y m o c z k o , L . S t r y e r , B i o c h e m i a , P W N , W a r s z a w a , 7 8 - 8 2 ( 2 0 0 5 ) .
S . M i l e w s k i , B i o c h e m i a , s k r y p t P o l i t e c h n i k i G d a Ds k i e j , 1 3 7 - 1 4 0 .
L . K By s z e j k o - S t e f a n o w i c z w i c z e n i a z b i o c h e m i i , P W N W a r s z a w a , 1 3 7 - 1 4 7 ; 2 4 6 - 2 5 1 ( 1 9 9 9 ) .
w i c z e n i e 4 . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j b i a Be k m e t o d f i l t r a c j i |e l o w e j 1 1 / 1 1
O s o b y w y k o n u j c e d o [w i a d c z e n i e :
K a r t a p r a c y
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I . K a l i b r a c j a k o l u m n y ( s e r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
M i e s z a n i n a d o p r z y g o t o w a n i a k r z y w e j w z o r c o w e j : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
O b j t o [: 0 . 7 5 0 m l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S k Ba d n i k 1 : B Bk i t d e k s t r a n o w y : 0 . 6 m g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S k Ba d n i k 2 : H e m o g l o b i n a : 1 . 0 m g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S k Ba d n i k 3 : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . m g
I l o [ z e b r a n y c h f r a k c j i o p o j e m n o [c i 2 m l : . . . . . . . . . . . . .
A n a l i z a w y c i e k u z k o l u m n y :
F r a k c j a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5
S k Ba d n i k
+ / -
1
a b s o r b a n c j a
»= 6 5 0 n m
+ / -
2
a b s o r b a n c j a
»= 4 6 2 n m
+ / -
3
a b s o r b a n c j a
»= . . . . . n m
O b j t o [ e l u c j i :
V O = V 1 = . . . . . . . . . m l
V 2 = . . . . . . . . . m l
V 3 = . . . . . . . . . m l
I I . O z n a c z a n i e m a s y c z s t e c z k o w e j n i e z n a n e j ±- a m y l a z y
±
±±
I l o [ z e b r a n y c h f r a k c j i o p o j e m n o [c i 2 m l : . . . . . . . . . . . . .
A n a l i z a w y c i e k u z k o l u m n y :
F r a k c j a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5
S k Ba d n i k
+ / -
A
a b s o r b a n c j a
»= 6 1 0 n m
O b j t o [ e l u c j i n i e z n a n e g o b i a Bk a : V A = . . . . . . . . . . . m l .
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