4380217157

ćwiczenie 3

Walidacja metody analitycznej wykorzystującej HPLC

Dr M. Slebioda, dr inż. P. Konieczka

Pan Marek Slebioda jest pracownikiem Perlan Technologies Polska Sp. z o.o.

ul. Puławska 303,02-785 Warszawa;

www.perlan.com.pl

Pan Piotr Konieczka jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej; [e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie uczestników z możliwością automatyzacji przygotowania, wykonania i opracowania testów związanych z walidacją metody chromatograficznej. Przeprowadzone zostanie wyznaczenia granicy oznaczalności (LOQ) i wykrywalności (LOD) kilku związków zawartych w mieszaninie w oparciu o metodę krzywej wzorcowej. Ogólny opis wymagań dotyczących walidacji metod chromatograficznych można znaleźć w odpowiednich artykułach ciał normalizujących ten proces. Skrót zawarty jest w publikacji [1].

Podstawowe definicje

Granica wykrywalności jest zdefiniowana jako ilość (lub stężenie) analitu dająca odpowiedz y_DL znacząco różną (trzy odchylenia standardowe s_B) od szumu tła y_B:

(■)    )v-:y» =^3s«

Pomimo możliwości zastosowania obliczeń elektronicznych bezpośredni pomiar y_B oraz s_B jest zwykle w metodach chromatograficznych niedogodny i niedokładny ze względu na małe wielkości mierzone. Wartość s_B może być zastąpiona przez oszacowanie błędu standardowego s_e z krzywej regresji ilość analitu względem odpowiedzi:

n-r/

(2)

gdzie y„fe, jest wartością obserwowaną

y_a, jest wartością obliczoną z krzywej kalibracyjnej n jest liczbą punktów kalibracyjnych 11 dla regresji liniowej wynosi 2

W punkcie odpowiadającym granicy wykrywalności y_DL = AC_DL + y_B, gdzie C_DL jest ilością analitu odpowiadającą granicy wykrywalności oraz A jest czułością analityczna (nachyleniem prostej regresji). Łącząc te równania otrzymuje się:

Jako granicę oznaczalności można uważać najmniejszą ilość analitu, która daje się oznaczyć z wystarczającą precyzją (dziesięć odchyleń standardowych s_B). Stosując oszacowanie błędu na podstawie linii regresji można ją obliczyć jako:

(4)

Prosram obliczeniowy

Do projektowania walidacji, zbierania danych i wykonania obliczeń zastosowany zostanie automatyczny program obliczeniowy Method Validation Pack [i] współpracujący z programem sterującym chromatografem. Po zebraniu danych i ich ocenie można w programie Method Validation Pack wygenerować automatycznie raport końcowy zawierający wyniki analizy statystycznej. Dostępne w programie wzorce walidacji pozwalają na szybką konfigurację testów zgodnie z zaleceniami ICH Q2A/2B, USP, EP, DIN oraz FDA. Istnieje możliwość dołączenia do raportu z walidacji elektronicznych wersji standardowych procedur operacyjnych oraz innych dokumentów związanych z procesem walidacji. Sposób działania programu przedstawiony jest schematycznie na rysunku 1.