1950083551

5.    Oczyszczenie płytki

Mikromacierz po hybrydyzacji musi zostać przygotowana do pomiaru intensywności promieniowania. Przede wszystkim należy usunąć sekwencje badane, które nie uległy hybrydyzacji, gdyż zawarty w nich barwnik mógłby zaburzyć pomiar emisji pochodzącej z cząsteczek dwuniciowych. Płytka zostaje umieszczona w odpowiednim roztworze, następnie myta wielokrotnie i ostatecznie suszona.

6.    Odczyt poziomów ekspresji

Duże stężenie wolnych sekwencji badanych w roztworze prowadzi do otrzymania w wyniku hybrydyzacji dużego stężenia połączonych helis w odpowiedniej komórce płytki. Fakt ten objawia się intensywniejszym oznakowaniem danej komórki.

W celu pomiaru intensywności promieniowania płytka jest skanowana przy pomocy odpowiedniego lasera. Odczytane wartości są zapisywane zgodnie z przyjętą jednostką i czułością urządzeń pomiarowych, a następnie przyporządkowywane opisom sond, które znajdowały się w określonych komórkach.

Odczyt wyników ze wszystkich płytek serii kończy część związaną z pomiarem poziomów ekspresji. Kolejne etapy dotyczą przetwarzania danych wynikowych i są silnie związane z celem całego doświadczenia. Dla poprawnej interpretacji pomiarów istotne jest prowadzenie szczegółowego protokołu laboratoryjnego oraz zapis wyników pośrednich, np. zeskanowane obrazy płytek. W ten sposób możliwe jest powtórzenie analizy poczynając od wybranego etapu.

Większość ścieżek analizy danych rozpoczyna się czyszczeniem i normalizacją danych. Czyszczenie odpowiada za zgrubną kontrolę poprawności danych pomiarowych. Zawiera między innymi eliminację błędów grubych oraz oznakowanie wartości brakujących. Normalizacja wykorzystuje informacje kontrolne do odpowiedniej modyfikacji rozkładów wartości pochodzących z każdej płytki. Umożliwia ona porównywanie wyników otrzymanych w kolejnych hybrydyzacjach. Proces ten jest szczegółowo omówiony w rozdziale 2.6.

Po wstępnej obróbce danych następuje bardziej zaawansowana analiza właściwa, która często kończy się graficzną prezentacją wyników.

2.5. Pomiar poziomu ekspresji

Eksperymenty wykonywane są w różnych warunkach, przy użyciu różnego rodzaju mikromacierzy oraz sprzętu pomiarowego. Z tego względu niezbędne jest podejście, które pozwoli na jakiekolwiek porównanie otrzymywanych wyników.

Ogólnie zastosowanie mikromacierzy pozwala na pomiar wartości poziomu ekspresji genów. Ze względu na brak standardu dla sposobu prowadzenia eksperymentów najczęściej przedmiotem analizy nie są otrzymywane wartości bezwzględne, lecz wartości odniesione do określonego poziomu.

W praktyce postulat ten realizowany jest poprzez jednoczesną hybrydyzację na pojedynczej macierzy dwóch różnie oznakowanych zestawów próbek. Oba zestawy dotyczą tego samego zakresu genomu. Jeden ma charakter kontrolny i jest tak przygotowany, aby dawać w przybliżeniu stały poziom ekspresji dla wszystkich genów. Drugi jest właściwym zestawem badanym. Ze względu na różne znakowanie aparatura pomiarowa może zmierzyć ekspresję osobno dla każdego zestawu. Na podstawie tych wartości dla każdego genu wyznaczany jest względny poziom ekspresji sekwencji badanych w stosunku do ekspresji sekwencji kontrolnych. Zauważmy, że jednoczesność pomiaru dla obu zestawów jest szczególnie istotna

19