2150626322

Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2014

Wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych

Proteazy (proteinazy, peptydazy) to duża grupa enzymów należących do klasy hydrolaz, przeprowadzających hydrolizę wiązań peptydowych. Ze względu na mechanizm katalizy proteazy podzielone zostały na następujące grupy:

•    proteazy serynowe,

•    proteazy treoninowe,

•    proteazy cysteinowe,

•    proteazy aspartylowe

•    metaloproteazy

•    proteazy glutamylowe

Niektóre proteazy odcinają końcowe aminokwasy od łańcucha peptydowego (egzopeptydazy, np. aminopeptydaza N, karboksypeptydaza A), a inne hydrolizują wewnętrzne wiązania peptydowe (endopeptydazy, np. trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna, trombina). Proteazy występują w komórkach wszystkich organizmów. Aktywność proteaz jest hamowana przez specyficzne inhibitory.

Ponad jedną trzecią wszystkich znanych enzymów proteolitycznych stanowią proteazy serynowe. Są one zaangażowane w różnorodne reakcje w organizmie poczynając od prostego trawienia białek w przewodzie pokarmowym po precyzyjnie regulowane kaskady np. kaskada krzepnięcia krwi. Centrum aktywne wszystkich proteaz serynowych zawiera trzy, położone blisko siebie, reszty aminokwasowe: histydynę, serynę i kwas aspartylowy, tworzące tzw. triadę katalityczną biorącą bezpośredni udział w hydrolizie wiązania peptydowego.

Trombina ( EC 3.4.21.5) to enzym osocza należący do proteaz serynowych. Produkowana jest z protrombiny osocza pod wpływem tromboplastyny i aktywatorów. Trombina umożliwia powstanie nierozpuszczalnej fibryny z rozpuszczalnego fibrynogenu umożliwiając krzepnięcie krwi. Trombina rozpoznaje sekwencję Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser i przecina wiązanie peptydowe pomiędzy resztami Arg i Gly. Enzym wykazuje aktywność w pH 5,0-10,0 (optimum to pH 8,3) i nie wymaga obecności dwu wartości owych jonów metali ani kofaktorów.

W ćwiczeniu badane białko, zawierające sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez trombinę, jest inkubowane z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz. Po zakończeniu inkubacji przeprowadza się elektroforezę badanego białka w żelu poi i akryl amidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w celu identyfikacji inhibitorów hamujących aktywność proteolityczną trombiny.