2150626323

Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wniesień 2014

Materiały i odczynniki

1.    Roztwór badanego białka w PBS (wg zaleceń prowadzącego ćwiczenia)

2.    Trombina (2U/pJ - bezpośrednio przed ćwiczeniami rozcieńczyć 50-krotnie w PBS)

3.    EDTA (80 mM roztwór w H2O pH 8,0)

4.    PMSF (16 mM roztwór w etanolu)

5.    PepstatynaA (16 pM roztwór w metanolu)

6.    Bufor PBS:

137 mM NaCl 2,7 mM KC1 10 mM Na₂HP0₄ 2 mM KH2PO4 pH 7,5

7.    Odczynnik Bradford

8.    Termoblok

9.    Odczynniki i zestaw do elektroforezy SDS-PAGE (patrz załącznik do ćwiczeń) Wykonanie ćwiczenia

1.    Oznaczyć stężenie badanego białka metodą Bradford (przepis strona 80).

2.    Badane białko poddać inkubacji z trombiną w obecności i bez inhibitorów proteaz według poniższego schematu (na podstawie podanych stężeń substancji używanych w doświadczeniu, należy samodzielnie obliczyć objętość tych substancji, którą trzeba dodać do probówki):

Uwaga! Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać wg przedstawionej kolejności

Składniki mieszaniny reakcyjnej	Probówka nr
	1 I 2 I ^3 4				5 6 7
PBS	uzupełnić do objętości 40 pl
Trombina (0,04 U/ pl)	0,4 U		0,08U	0,4 U	0,4 U	0,4 U	0,4 U
EDTA 80 mM	-				10 mM	-	-
PMSF 16 mM						2 mM	-
Pepstatyna A 16 pM					-	-	2 pM

Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować 10 min. w temperaturze pokojowej, a następnie dodać badane białko

Badane białko 10 pg 10 pg 10 pg 10 pg 10 pg 10 pg