274845121

Tyrozynaza została oczyszczona zgodnie z procedurą opisaną przez Sharama i współpracowników (2003). 200 g rozdrobnionych pieczarek zamrożono w temp. -20°C na okres 12 godzin. Następnie przeprowadzono ekstrakcję białek z mrożonych pieczarek, używając najpierw czystego acetonu schłodzonego do temp. -20°C, a następnie roztworu 30% acetonu w wodzie destylowanej. Tak wyekstrahowane białka zostały następnie wytrącone z roztworu wodnego schłodzonym acetonem, odwirowane i zawieszone w 0,1 M sodowym buforze fosforanowym o pH 7,0.

W kolejnym etapie wykonano frakcjonowanie białek siarczanem amonowym. Do preparatu dodano siarczan amonu w ilości potrzebnej do otrzymania roztworu o stężeniu końcowym równym 10% roztworu nasyconego, preparat odwirowano, a osad odrzucono. Do otrzymanego supernatantu dodano kolejną porcję soli do uzyskania stężenia równego 60% nasycenia. Preparat ponownie odwirowano, a osad zawieszono w 0,1 M sodowym buforze fosforanowym (pH 7,0) i roztwór poddano dializie względem tego samego buforu. Dializę prowadzono przez 12 godzin w temp. 2—4°C przy ciągłym mieszaniu buforu, uzyskując „preparat tyrozynazy”.

Wykonanie

Materiały i odczynniki

1.    Preparat tyrozynazy otrzymany z pieczarek

2.    Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywności tyrozynazy zawierającej 0,1 M sodowy bufor fosforanowy pH 7,0, 10 mM askorbinian sodu, 7,5 mM tyrozynę (40 ml)

3.    2 M roztwór NaOH (35 ml)

4.    2 M roztwór HC1 (30 ml)

5.    20 ml 15% (wag./obj.) roztworu molibdenianu sodu zmieszanego z 20 ml 15% (wag./obj.) azotynu sodu (NaNC>2) (40 ml)

6.    10 mM roztwór wzorcowy L-DOPA. Odważyć bardzo dokładnie naważkę L-DOPA (na 5 ml). Tuż przed użyciem rozpuścić w ogrzanej do temp. około 60°C mieszaninie reakcyjnej do oznaczania aktywności tyrozynazy

7.    Odczynnik Bradford. 100 mg Coomassie Blue G-250 rozpuścić w 50 ml 96% etanolu. Do tego roztworu dodać 100 ml 85% (wag./obj.) kwasu ortofosforowego. Otrzymany roztwór rozcieńczyć wodą destylowaną do objętości końcowej 1 1. Przechowywać w ciemnej butelce w lodówce.

Materiały pomocnicze i aparatura

Szklana zlewka o objętości 25 ml, mieszadło magnetyczne, cylinder miarowy o objętości 25 ml, pipeta automatyczna (1 ml), spektrofotometr lub kolorymetr z filtrem dla 390 nm, kuwety spektrofotometryczne

A. Produkcja L-DOPA w obecności tyrozynazy, oznaczanie aktywności tyrozynazy

Zlewkę o poj. 25 ml (podpisaną jako I) napełnić 10 ml mieszaniny reakcyjnej do oznaczania aktywności tyrozynazy. W zlewce umieścić mieszadełko magnetyczne. Przygotować zestaw probówek (7 sztuk) wg poniższego schematu i odmierzyć do każdej probówki po 500 pl 2 M HC1.

Zestaw probówek dla prób pobieranych ze zlewki I

I<>    120 U IftO I» I|00    I|20

dinitropochodna

L-DOPA    dinitrochinon

(żółte zabarwienie) (czerwonopomarańczowe zabarwienie)