2906542628

NOWE W BIOCHEMII 255

Aby uzyskać czysty gen Schimke i współpracownicy oczyścili mRNA genu reduktazy z opornych na ametopterynę mysich komórek AT — 3000. Następnie zaś użyli ów mRNA do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) przez odwrotną transkryptazę. Do syntetycznego genu (cDNA) dołączono — działając terminalną transferazą — pojedynczoniciowe końce poli(dC). Jednocześnie przygotowano jako wektor plazmid pDR 322. Plazmid, który izoluje się w formie kolistej, przeprowadzono w formę liniową nacinając go enzymem restrykcyjnym Pst I, po czym stosując terminalną transferazę dołączono pojedynczoniciowe końce poli(dG). Po zmieszaniu syntetycznego genu z wektorem utworzyły się między innymi koliste asocjaty obu DNA utrzymywane przez powstałe wiązanie wodorowe między odcinkami poli(dC) i poli(dG), które stanowią syntetyczne „lepkie” końce wektora i genu. Zrekombinowany tak DNA został użyty do transformacji E.coli szczepów (kappa) 1776 i 2282 (wariant thy+) (szczepy zatwierdzone przez Narodowy Instytut Zdrowia U.S.A. do stosowania jako bezpieczne w pracach badawczych ze zrekombinowanym DNA z organizmów wyższych) (6).

Uzyskano kilkanaście klonów bakteryjnych, w których metodą hybrydyzacji DNA w komórkach z cDNA reduktazy mysiej, wykazano obecność plazmidu pDR 322, zawierającego włączony podczas rekombinacji fragment DNA (1500 par zasad) odpowiadający syntetycznemu genowi reduktazy (6,7). Bakterie zawierające zrekombinowany plazmid rosły w pożywkach z trimetoprimem w wysokich stężeniach, w jakich giną komórki kontrolne, bez plazmidu. Co więcej analiza sekwencji nukleo-tydów w plazmidowym cDNA mysiej reduktazy dihydrofolianowej z komórek E. coli opornych na trimetoprim pozwoliła na bezpośrednie stwierdzenie, iż rzeczywiście występuje w nim odcinek odpowiadający sekwencji aminokwasów mysiego enzymu. Ekstrakty bakterii zawierających zrekombinowany plazmid redukowały folian, co wskazywało że zawierają zwierzęcą reduktazę dihydrofolianową, która — w przeciwieństwie do reduktazy bakteryjnej — może redukować do tetrahydrofolianu i folian i dihydrofolian. Autorzy wnioskowali zatem, że komórki E. coli zawierające zrekombinowany plazmid syntetyzowały białko o strukturze i właściwościach zwierzęcej reduktazy dihydrofolianowej, którego transkrypcja i translacja rozpoczynała się od sygnału startowego obecnego we włączonym do plazmidu fragmencie DNA. Ze specyficznej aktywności ekstraktów, znając aktywność specyficzną mysiej reduktazy dihydrofolianowej i parametry wiązania przez nią ametopteryny autorzy oszacowali, że w badanych ekstraktach z komórek E. coli we frakcji rozpuszczalnych białek enzym mysi stanowił 0.01%.

Zwierzęce pochodzenie reduktazy dihydrofolianowej zakodowanej przez zre-kombinowane plazmidy w komórkach E.coli potwierdzano stosując test radioimmu-nologiczny (solid phase sandwich radioimmuno assay). Zastosowanie nowej, nieopu-blikowanej dotąd metody, która pozwala na immunologiczną charakterystykę białek w żelu po elektroforezie doprowadziło do wykazania, że owe białko z E. coli reagujące z przeciwciałem wytworzonym przeciw mysiej reduktazie dihydrofolianowej ma tę samą ruchliwość elektroforetyczną co enzym z komórek mysich o ciężarze cząsteczkowym 22.000. Immunologicznie reaktywne białko o tej samej ruchliwości można było również otrzymać z ekstraktów przez zastosowanie chromatografii powinowactwa na kolumnie z ametopteryną i elucję roztworem folianu. Wskazywało to, że izolowane białko o ciężarze cząsteczkowym 22.000 ma miejsca wiążące folian i ametopterynę, jak zwierzęca reduktaza dihydrofolianową.

Przedstawione wyniki pozwalają wnioskować, że skonstruowane przez Schim-kego i współpracowników klony bakteryjne syntetyzowały reduktazę dihydrofolianową zakodowaną przez mysie cDNA. Oczywiście nie wszystkie z otrzymanych klonów bakteryjnych zawierały plazmid z pełnym genem reduktazy dihydrofolianowej. W komórkach takich klonów udało się wykazać peptyd, który chociaż krótszy