3725451933

*    metoda Boydena. Stosuje się specjalne komory z filtrem miliporowym (błona nitrocelulozowa) o wielkości porów 3 - 5 um (dla granulocytów) i 8 um (dla makrofagów). Po inkubacji i zabarwieniu liczy się komórki, które przechodzą przez błonę w kierunku bodźca chemotaktycznego.

Studenci oglądają płytką z „zabarwionymi śladami" migrujących komórek.

Ocena zdolności fagocytarnych

Ważnym etapem fagocytozy jest rozpoznanie cząsteczki fagocytowanej przez receptory fagocyta: FcR (dla przeciwciała) i CR (dla C3b dopełniacza). Zdolność fagocytarną komórek żernych najczęściej określa się w stosunku do bakterii (Staphylococcus aureus, pałeczki Gram-ujemne) lub grzybów (Candida), rzadziej cząstek mineralnych (lateks).

*    metoda Wrighta (probówkowa) - do 1 ml pełnej krwi (zawiera opsoniny) pobranej na cytrynian sodu dodaje się odpowiedniej gęstości zawiesinę bakterii lub grzybów (mogą być żywe lub zabite). Inkubuje 30 min. w temp. 37° C, odwirowuje, z kożuszka krwinek białych sporządza rozmaz na szkiełku podstawowym, barwi metodą Giemsy i w mikroskopie świetlnym oblicza: odsetek komórek fagocytujących (liczy się granulocyty obojętnochłonne, ale fagocytują też monocyty) oraz indeks fagocytamy tj. średnią liczbę drobnoustrojów sfagocytowanych przez jeden fagocyt. Wyższe wskaźniki fagocytame uzyskuje się stosując żywe zawiesiny drobnoustrojów. W modyfikacji można zastosować izolowane np. na Gradisolu fagocyty oraz inkubowane wcześniej z surowicą drobnoustroje.

Studenci oglądają preparaty barwione z fagocytozą gronkowców. Fagocytują przede wszystkim granulocyty obojątnochlonne (PMN) oraz monocyty.

Wartości u zdrowych dorosłych osób: odsetek fagocytujących PMN 60 80%, indeks fagocytarny 5-10 gronkowców sfagocytowach przez jeden PMN.

Wartości podwyższone występują w ostrych zakażeniach bakteryjnych, obniżone występują w niedoborach układu fagocytarnego, w przewlekłych zakażeniach bakteryjnych.

Ocena wewnątrzkomórkowego zabijania (killing)

Do badania stosuje się tylko żywe zawiesiny. Testy pozwalają określić kinetykę zabijania.

*    metoda biologiczna - zawiesinę leukocytów inkubuje się z opsonizowanymi bakteriami. Po np. 15, 30, 60 min. doprowadza się do lizy fagocytów i uwolnione nie zabite bakterie wysiewa na agar a następnie liczy wyrośnięte kolonie - c.f.u. (colony forming units). Znając ilość wyjściowej zawiesiny można obliczyć % zabijania. Metoda bardzo pracochłonna.

*z oranżem akrvdvnv - po inkubacji fagocytów z żywymi bakteriami dodaje się oranżu akrydyny i w mikroskopie fluorescencyjnym liczy % zabitych (czerwone) i żywych (zielone) bakterii wewnątrz fagocyta. Metoda pozwala ocenić zdolność pochłaniania i zdolność zabijania.

Studenci wykonują i oceniają test. Na szkiełka nakrywkowe daje się kroplą świeżej krwi, po 1 godz. zdejmuje skrzep i dodaje zawiesiny: gronkowce, pałeczki, drożdżaki wcześniej opsonizowane surowicą (dopełniacz + przeciwciała). Po następnej godzinie dodaje oranżu akrydyny i ogląda szkiełka położone odwrotnie na szkiełku podstawowym w mikroskopie fluorescencyjnym.

*    metoda izotopowa - opiera się na wiązaniu znakowanej trytem tymidyny przez bakterie niepochłonięte przez fagocyty. W teście można oceniać fagocytozę i zabijanie. W liczniku scyntylacyjnym mierzy się stopień radioaktywności samych bakterii oraz sfagocytowanych i oblicza indeks fagocytamy oraz indeks zabijania.

Ocena wewnątrzkomórkowego metabolizmu fagocytów

Wewnątrzkomórkowe zabijanie i degradacja pochłoniętych cząstek odbywa się na drodze zależnej od tlenu, związanej z wybuchem tlenowym komórki żernej (generacja rodników ponadtlenkowych) i tlenowo niezależnej.

Do oceny służą następujące testy:

*    Test NBT - w przebiegu procesów tlenowych wzrasta poziom nukleotydów NADH i NADPH.

Nukleotydy wykazują zdolność redukcji pochłoniętego błękitu nitrotetrazoliowego (NBT) do formazanu. Przy prawidłowej funkcji metabolicznej w fagocytach odkładaja się w cytoplazmie nierozpuszczalne ciemnoniebieskie złogi formazanu.

-    Test spontaniczny - roztwór NBT dodaje się do heparynizowanej krwi żylnej, 20 min. inkubuje, wykonuje rozmazy, barwi Giemsą lub safraniną i oblicza w mikroskopie liczbę komórek NBT (+). Wartości prawidłowe: 0 - 14% komórek NBT (+). Wartości podwyższone przemawiają za toczącą się infekcją bakteryjną (pasożyty zewnątrzkomórkowe), wartości obniżone wymagają wykonanie testu pobudzonego.

-    Test pobudzony - do pobudzenia możemy użyć zawiesinę lateksu, bakterii, endotoksynę.