3725451937

pozbawiona własnego dopełniacza (podgrzana wcześniej do temp. 56° C) + antygen + dopełniacz, inkubacja, następnie dodaje się system wykrywający: krwinki czerwone owcy + przeciwciała swoiste (amboceptor króliczy). Brak hemolizy świadczy o obecności poszukiwanych przeciwciał - odczyn dodatni, obecność hemolizy - odczyn ujemny. Prawidłowe wykonanie odczynu wymaga odpowiednich kontroli i precyzyjnej standaryzacji. Do niedawna był stosowany w diagnostyce kiły jako tzw. odczyn Wassermana (jakościowy) lub Kolmera (ilościowy)

Studenci oglądają schemat wykonania odczynu Wassermana.

5. Diagnostyka immunologiczna

Generalnie reakcje antygen-przeciwciało są szeroko wykorzystywane w diagnostyce klinicznej i służą do identyfikacji oraz oznaczeń ilościowych zarówno antygenów jak i przeciwciał. W zależności od stanu fizycznego antygenu (komórka bakteryjna, krwinka, fragmenty komórki, białko, polisacharyd...) i charakteru interakcji wyróżnia się dwie zasadnicze grupy metod: oparte na aglutynacji i precypitacji. Poszczególne metody mają różną czułość i swoistość.

Reakcje antygen-przeciwciało, które zachodzą in vivo lub można badać tylko w organizmie żywym (żywa komórka)to: opsonizacja, neutralizacja toksyny, neutralizacja virusa.

Metody oparte o zjawisko aglutynacji

Przeciwciała łączą się z nierozpuszczalnym antygenem/antygenami znajdującymi się na powierzchni cząstki stałej (komórka bakteryjna, krwinka, cząstki lateksu), prowadzą do zlepiania się tych cząstek i powstawania widocznych gołym okiem tzw. aglutynatów. Mówimy o aglutynacji bakteryjnej, lateksowej, hemaglutynacji. Odmiany testów:

* aglutynacja szkiełkowa - test jakościowy, najczęściej służy do wykrywania nieznanych antygenów przy pomocy znanych przeciwciał swoistych. Stosowany jest rutynowo w identyfikacji szczepów, tzw. typowaniu serologicznym, np. Salmonella, Shigella, E. coli. Pozwala określić gatunek lub serotyp. Wykonanie: na szkiełko podstawowe daje się kroplę surowicy zawierającej swoiste przeciwciała, następnie rozprowadza ezą identyfikowany szczep bakterii. W ciągu 1 - 2 min. powstaje aglutynacja. Obowiązkowo należy zrobić kontrolę szczepu w fizjologicznym roztworze NaCl - nie powinna powstać aglutynacja (szczep gładki), jeżeli powstaje - jest to szczep szorstki, z którym nie można wykonać aglutynacji, bo daje tzw. pseudoaglutynację. W przypadku użycia krwinek (oznaczanie grup krwi) mówimy o hemaglutynacji. Studenci wykonują aglutynacją szkielkową typują enteropatogenne szczepy E. coli oraz krwinki barana *aglutvnacja probówkowa - służy najczęściej do wykrycia i ustalenia miana przeciwciał w surowicy przy pomocy znanych antygenów. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia surowicy w fizjologicznym roztworze NaCl, np. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80....(rozcieńczenia ustala się w zależności od spodziewanego miana). Następnie do probówek dodaje się stałą zawiesinę antygenu, inkubuje 18 godz. wtemp. 37°C i odczytuje w aglutynoskopie. Miano przeciwciał jest to najwyższe rozcieńczenie surowicy, w której stwierdza się jeszcze aglutynację.

Klasycznym przykładem wykorzystania aglutynacji probówkowej jest odczyn Widala, stosowany w diagnostyce duru brzusznego i paradurów. Wykrywamy przeciwciała przeciwko antygenom somatycznym O (aglutynacja grudkowa) i antygenom rzęskowym H (aglutynacja obłoczkowa). Inne odczyny: Wrighta - w diagnostyce brucelozy, Wiel-Felixa - w diagnostyce duru plamistego.

Studenci oceniają aglutynacją probówkową, grudkową i rząskową S. typhi oraz miano przeciwciał (odczyn Widala)

*aglutvnacia pośrednia - polega na reakcji przeciwciał z antygenem opłaszczonym na nośniku, którym może być lateks. W przypadku opłaszczenia lateksu przeciwciałami możemy wykryć antygen - na tej zasadzie oparte są testy lateksowe, służące do różnicowania paciorkowców hemolizujących (Strepto-kit). ^hemaglutynacja bierna - odczyn wykonuje się na płytkach z zagłębieniami, do których najpierw daje się rozcieńczenia surowicy a następnie krwinki opłaszczone antygenem. Po 2 godz. inkubacji w temp. pokojowej występuje hemaglutynacja i można określić miano. Odmianą tego odczynu jest zahamowanie hemaglutynacji biernej, kiedy wstępnie materiał inkubuje się z surowicą wzorcową zawierającą przeciwciała a następnie dodaje krwinek opłaszczonych homologicznym antygenem. Metody te są stosowane do wykrywania antygenów wirusowych, hormonów.

*odczvn Coombsa - służy do wykrycia tzw. przeciwciał niekompletnych (zwykle IgG), które są zbyt krótkie i nie mogą przyłączyć antygenów na różnych komórkach i wytworzyć widocznej sieci, opłaszczają tylko pojedyncze komórki. Aby uwidocznić reakcję dodaje się surowicy antyglobulinowej, zawierającej przeciwciała przeciwko białkom immunoglobulinowym (stanowią antygen), które doprowadzają do aglutynacji. Odczynem tym (pośredni) wykrywa się przeciwciała anty-RhD w surowicy matki w przypadku konfliktu serologicznego. Natomiast u dziecka wykonuje się tzw. bezpośredni odczyn Coombsa - dodaje się surowicy antyglobulinowej do krwinek dziecka, ponieważ są one już opłaszczone przeciwciałami. W