3870137265

56 Z. GDANIEC

nem H3’jednej reszty nukleotydowej z końca 5’, a atomem fosforu następnej reszty. Korelacje intranukleotydowe pomiędzy jądrem ^jlP a protonami H4’, H5’ i H5”, chociaż o stosunkowo małej intensywności, są często obserwowane i stanowić mogą dodatkową pomoc w identyfikacji sygnałów pierścienia cukrowego.

Ogromną wadąopisanej powyżej strategii jest niejednoznaczność przypisań opartych na sekwencyjnych kontaktach NOE, które wymagają założenia co do konformacji elementów strukturalnych badanej sekwencji. Należy pamiętać, że metodologia przypisywania sygnałów w oparciu o korelacje NOE jest prawdziwa tylko dla regularnych, helikalnych regionów A-RNA i B-DNA. Ostatnio wykiyto takie zależności także dla lewoskrętnej helisy Z-RNA [21].

4. STRATEGIA PRZYPISYWANIA SYGNAŁÓW DLA CZĄSTECZEK

ZNAKOWANYCH IZOTOPOWO

Dla przypisania sygnałów rezonansowych kwasów nukleinowych całkowicie znakowanych izotopami ^l3C i ^l5N zaproponowano do tej pory wiele różnych eksperymentów, a obszerny ich opis można znaleźć w pracach przeglądowych [18-23].

Dostęp do preparatów znakowanych izotopami ^l5N i ^l3C dostarczył badaczom nowych narzędzi w przezwyciężaniu problemów napotykanych w eksperymentach homojądrowych. W literaturze napotkać można zasadniczo dwie strategie przypisania sygnałów, dla znakowanych izotopowo cząsteczek kwasów nukleinowych. W pierwszej z nich, opierającej się głównie na analizie kontaktów NOE [2, 11 ], przypisywanie sygnałów dokonywane jest w oparciu o różne techniki ^,3C/^l5N-edycj i widm NOESY i TOCSY. W drugiej, preferowanej ostatnio metodzie [23,20], dla identyfikacji sygnałów wykorzystuje się korelację poprzez sprzężenia skalarne, gdzie obecność sygnału korelacyjnego w widmie jednoznacznie dowodzi istnienia wiązania chemicznego pomiędzy jądrami zaangażowanymi w oddziaływania. Zastosowanie tego podejścia rozwiązuje problem niejednoznaczności przypisań napotykany w metodach opartych na sekwencyjnej analizie sygnałów NOE.

Pierwszym etapem analizy widm cząsteczek znakowanych izotopowo jest identyfikacja sygnałów pochodzących od protonów niewymienialnych (H2, H5, H6, H8) i protonów wymienialnych (iminowych i aminowych) zasad nukleinowych. W następnej kolejności przypisuje się protony należące do reszt cukrowych (H1’, H2\ H3’, H4’, H5’, H5”). Sygnały pochodzące od poszczególnych reszt zasad koreluje się z odpowiadającymi im resztami cukrowymi w zależności od stosowanej strategii, albo poprzez obserwację kontaktówNOE pomiędzy protonami aromatycznymi i H1’, lub też poprzez bezpośrednią korelację sygnału H1 ’ poprzez sprzężenia skalarne z sygnałami atomu azotu wiązania N-glikozydowego. Sekwencyjne połączenie pomiędzy kolejnymi resztami nukleotydowymi otrzymywane jest albo za pomocą eksperymentów NOE lub też wykorzystując korelacje poprzez wiązania wzdłuż szkieletu fosforocukrowego. W ten sposób możliwe jest często przypisanie prawie wszystkich sygnałów w widmach NMR kwasów nukleinowych.