3893820140

X*X<»

Dzień 4. Western biot

W trakcie ćwiczeń wykorzystamy niewyznakowane przeciwciała pierwszorzędowe rozpoznające histon H3 z ufosforylowaną seryną 10 i drugorzędowe sprzężone z peroksydazą z chrzanu. Materiały:

-    nie barwiony żel poliakrylamidowy z rozdzielonymi białkami (może być przechowywany przez noc w 4°C, zabezpieczony wilgotną bibułą i folią).

-    membrana Westran (wielkoś porów 0,2 pm)

-    bibuła Whatman

-    transblotter

-    zasilacz

-    kołyska laboratoryjna

-    krulicze przedwaciała pierwszorzędowe anty-jr, fosfo(serl 0)-histon H3 rozcieńczone w buforze

TBST 1:5 000 w 5% mleku z azydkiem sodu Odczynniki: bufor TGM:

25 mM Tris 192 mM glicyna 20% metanol TBST:

20 mM TrisHCl pH 8.0 165 mMNaCl

0.2 % Tween

odtłuszczone mleko w proszku krulicze przeciwciała pierwszorzędowe (anty-fosfo (serlO)- histon H3) przeciwciała drugorzędowe (anty-krulicze sprzężone z peroksydazą z chrzanu)

IM Tris-HCl pH 8

250 mM luminol rozpuszczony w DMSO (Dimetylosulfotlenek)

90 mM kwas p-kumarynowy rozpuszczony w DMSO

30% nadtlenek wodoru (perhydrol)

100% tlenek di wodoru

Przygotowanie membran do transferu W technice westem-blot wykorzystuje się różne membrany. W trakcie ćwiczeń wykorzystujemy membranę Westran, która jest membraną hydrofobową PVDF.

Wykonanie:

1. Wyciąć membrany nieco większe (ok. 2-5 mm) od wielkości żelu (uwaga: nie dotykać membrany palcami, używać rękawiczek i pęset).

2.    Umieścić na 15 sekund w metanolu, przepłukać dobrze wodą destylowaną i umieścić w buforze do transferu TGM na kołysce na ok. 10 - 15 minut. Przygotować 8 kawałków (wielkości membrany) bibuły Whatman.

Układanie transferu

3.    Ułożyć na blacie aparatu do transferu: 4 kawałki bibuły Whatman nasączonej buforem TGM, następnie membranę, żel i kolejne

4    bibuły przygotowane jak powyżej. Przy układaniu transferu należy uważać, aby nie tworzyły się pęcherze powietrza pomiędzy kolejnymi warstwami. Na koniec całość można „przerolować” (np. falkonem) i delikatnie wycisnąć spomiędzy warstw ewentualne pęcherze.

4.    Nałożyć pokrywy i przeprowadzić transfer

przez ok. 2 godziny przy stałym napięciu 25V i natężeniu 1,5 - 2 mA na cm² żelu -im krótszy transfer tym wyższe natężenie. Uwaga:    w stosowanym na ćwiczeniach

transbloterze nie wolno przekraczać napięcia 25 V!

5.    Po zakończeniu transferu żel wybarwić a membranę przenieść do roztworu blokującego (TBST + 5% mleko odtłuszczone) i zostawić na kołysce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 min. Na tym etapie, membranę można przechowywać w 4°C przez kilka dni.

6.    Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone 1:2500 w lOml TBST z 5% mlekiem i pozostawić przez noc na kołysce w 4°C.

7.    Odpłukać przeciwciała roztworem TBST: 2 razy

5    min., 2 razy 15 min.

8.    Dodać przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczyć 1:5000 w TBST z mlekiem) i pozostawić na kołysce w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.

9.    Odpłukać jak wyżej.

UWAGA:

Nie pozwolić membranie wyschnąć. Obchodzić się z nią delikatnie. Używać pęsety. W celu zmniejszenia zużycia przeciwciał należy używać jak najmniejszej objętości buforów, pamiętając jednak, że konieczne jest całkowite zanurzenie membrany.