3893820146

ładunku histonów i osłabienia ich wiązania do DNA (acetylacja, fosforylacja) lub zaburzeniu struktury nukleosomu (modyfikacje w obrębie domeny globularnej). Drugim mechanizmem działania modyfikacji jest ich wpływ (promujący lub hamujący) na wiązanie białek regulujących strukturę chromatyny. Białka te odczytują znaczenie danego wzoru modyfikacji i powodują dalsze modyfikacje chromatyny - samodzielnie lub poprzez rekrutację innych czynników (np. ATP-zależnych kompleksów remodelujących chromatynę). Z mechanizmem tym związana jest hipoteza kodu histonowego, mówiąca

0    tym, że określone wzory modyfikacji histonów decydują o stanie chromatyny i aktywności genów w jej obszarze, a w konsekwencji na określony efekt biologiczny. Potwierdzeniem hipotezy kodu histonowego była m.in. identyfikacja domen białkowych wiążących określone modyfikacje histonów rdzeniowych, takich jak bromodomena wiążąca acetylowane histony czy chromodomena wiążąca niektóre typy metylowanych histonów.

Fosforylacja histonu H3

Zależna od cyklu komórkowego fosforylacja histonu H3 w serynie 10 (H3S10ph) jest konserwowana wśród organizmów eukariotycznych. Ta dynamiczna potranslacyjna modyfikacja jest zaangażowana zarówno w aktywację transkrypcji jak i w kondensację oraz segregację chromosomów.

Wiele procesów zachodzących w trakcie mitozy jest uzależnionych od upakowania chromatyny do jej mitotycznej formy. Pojawia się coraz więcej dowodów na to, że upakowanie chromosomów jest regulowane midzy innymi poprzez potranslacyjną modyfikację histonów - fosforylację. Obecnie fosforylacja histonu H3 jest uznawana za jeden z mitotycznych biomarkerów.

Z obserwacji wielu organizmów wynika, że poziom fosforylacji histonu H3 jest niski w czasie interfazy, wzrasta na początku podziałów komórkowych i opada podczas telofazy. W przypadku komórek zwierzęcych mitotycznie specyficzna fosforylacja H3S10 rozpoczyna się w późnej fazie G2 w obszarach perycentromerycznych    heterochromatyny

1    rozprzestrzenia się w sposób uporządkowany i zbieżny z kondensacją chromosomów. Modyfikacja ta jest jednolicie dystrybuowana na chromosomy zarówno w mitozie jak mejozie.

U roślin, w trakcie podziałów mitotycznych poziom fosforylacji jest wysoki w częściach perycentromerycznych i niski w obszarach ramion chromosomów. Ta specyficzna dla perycentromerów fosforylacja może być zaburzona przez działanie stresu chłodu lub działanie inhibitorów fosfataz. Wyjątkiem są rośliny o chromosomach policentromerycznych, u których fosforylowane są histony H3 na całej długości chromosomów. W przypadku podziałów mejotycznych istnieją różnice pomiędzy pierwszym a drugim podziałem. Podczas pierwszego podziału mej otycznego fosfoiy lowane są histony H3 na całym chromosomie, podczas gdy w trakcie drugiego podziału fosforylacja ograniczona jest, podobnie jak w mitozie, do obszarów perycentromerów. Podobny profil wykazuje również fosforylacja histonu H3 w serynie 28.

Tak szczegółowy obraz zmian modyfikacyjnych poznano przy użyciu przeciwciał specyficznych dla ufosforylowanych epitopów histonu H3.

Ćwiczenie polega na obserwacji zmian w fosforylacji Histonu H3 w komórkach roślinnych dzielących się i w fazie G₀. W tym celu należy wyizolować białka histonowe, przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE, a następnie detekcję białek typu Western.

Hodowle komórek roślinnych in vitro

Kultury zawiesinowe komórek roślinnych stanowią homogenną populację komórek, łatwo dostępnych dla podawanych z zewnątrz substancji i rosnących w określonych, sterylnych warunkach. Są zatem dobrym materiałem do badań ścieżek metabolitów wtórnych, indukcji enzymów, czy ekspresji genów. Stosunkowo łatwa jest także izolacja enzymów i innych białek z komórek hodowanych w zawiesinie. Brak lub niewielka zawartość chlorofilu i innych barwników ułatwia doświadczenia. Stosując różnego rodzaju inhibitory można synchronizować zawiesiny komórkowe, czyli doprowadzić do stanu, w którym wszystkie komórki w zawiesinie znajdują się na tym samym etapie cyklu komórkowego. Poprzez „głodzenie” komórek można zahamować podziały komórkowe i wprowadzić je w fazę G₀.

W trakcie ćwiczeń jako materiał badawczy posłuży linia komórkowa tytoniu TBY-2.

Linia komórkowa TBY-2 (Tobacco Bright-Yellow) została wyprowadzona z komórek mezofilu liści przez Nagatę i współpracowników na początku lat 90-tych. Komórki hodowane są w płynnej pożywce MS (Murashige i Skoog) wzbogaconej o 2,4-D i witaminę B5, w ciemności, w temperaturze ok. 25°C przy stałym wytrząsaniu (125 obrotów na minutę).