3893820153

Klonowanie DNA jest metodą pracy z DNA pozwalającą na otrzymanie milinów identycznych kopii cząsteczek DNA o żądanej sekwencji. Na początku tego procesu wyizolowane z komórki człowieka DNA oraz plazmidy bakteryjne/ bakteriofagowe tnie się przy użyciu odpowiednich restryktaz pozostawiających lepkie końce. Następnie miesza się przecięte fragmenty DNA i plazmidów, które odnajdują wzajemnie swoje wolne końce i pod wpływem dodanej ligazy wytwarzają między sobą wiązania kowalencyjne (zrekombinowany plazmid). Tak powstały wektor (służy do przenoszenia fragmentów DNA do komórek, sztucznie zmodyfikowany) wprowadza się do komórek bakterii, który to proces musi poprzedzić umieszczenie bakterii w roztworze chlorku wapnia o temperaturze 273 K w celu osłabienia ich ścian komórkowych i umożliwienia wprowadzenia wektora (transformacja). Następnie na drodze hybrydyzacji (powstawanie dwunicieniowych struktur z połączenia

Ki

\4‘

rw

/ nitrocelutozcrwy

Filtr z bakteriami

Dodanie

wyznakowanej * * radioaktywnie sondy    »V*

pobranymi z kolonii,

i komórki są rozbite.

(c)

Czysc cząsteczek radioaktywne) sondy hybrydyzuje

. IWA

Z OWA niektórych

U

3 Hybrydyzacja DNA przy użyciu sondy

komplementarnych nici DNA), za pomocą sondy (krótki fragment poszukiwanej sekwencji z dodatkiem radioaktywnego fosforu) identyfikuje się kolonię bakterii zawierającą poszukiwaną sekwencję. W metodzie z sondą należy uprzednio przyłożyć do powierzchni hodowli celulozowy/ nylonowy krążek do którego przyczepiają się komórki z każdej kolonii dając replikę wszystkich kolonii na szalce. Następnie krążki płucze się w roztworze wodorotlenku sodu powodując rozpad DNA na fragmenty jednonicieniowe i wiąże się je promieniami UV z podłożem. Tak przygotowany krążek umieszcza się w roztworze z sondą, która przyłącza się tylko do sekwencji komplementarnej do niej. Po wypłukaniu i wysuszeniu przykłada się go w ciemności do kliszy fotograficznej i wywołuje (jeżeli nastąpiło zespolenie DNA z sondą powstaje zaciemnienie na kliszy, jej porównanie z oryginalną szalką pozwala zidentyfikować poszukiwaną kolonię). Z tak zidentyfikowanej kolonii pobiera się małą ilość bakterii i umieszcza na kilkanaście godzin w świeżej pożywce, po czym z mikroorganizmów izoluje się plazmidy poddawane następnie działaniu nukleazy restrykcyjnej oraz procesowi elektroforezy, podczas której jeden z powstałych prążków będzie utworzony wyłącznie z