5192605658

38 A. KOZIK [6]

ligandu wolnego. Ilość ligandu związanego obliczyć można przez scałko-wanie szczytu dodatniego lub ujemnego.

Chromatografia musi zapewnić całkowity rozdział obu pasm, przy czym białko nie może być oddzielane od kompleksu. Wymaganie to można łatwo spełnić wybierając taki typ żelu, w którym białko oraz kompleks wypływają w objętości pustej. Ponadto tworzenie kompleksu musi być procesem dostatecznie szybkim. Nie jest natomiast konieczne uwzględnianie ewentualnego zjawiska wiązania ligandu przez żel.

Zaletą metody Hummela i Dryera jest prostota oraz stosunkowo niewielkie zużycie białka. Pod względem precyzji z pewnością nie ustępuje ona klasycznej dializie równowagowej (35).

Omawianą technikę zastosowano z powodzeniem m.in. do badania oddziaływania pochodnych tryptofanu (35) oraz detergentów (36) z albuminą surowicy, różnych enzymów z ich efektorami i substratami (37—39), solubilizowanych receptorów błonowych z toksynami (40), czynników białkowych z fluoryzującą sondą hydrofobową — anilinonaftalenosulfo-nianem (41, 42) i in.

Teoretyczne rozważania nad kształtami profili elucji w chromatografii żelowej prowadzonej techniką analizy czołowej wykazały możliwość zastosowania tej metody do badania szybko ustalających się równowag, m.in. typu P4-nQ^PQ_n (43—47). Zasada metody jest następująca (ryc. 1 C). Na kolumnę zrównoważoną buforem wprowadza się mieszaninę białko-ligand aż do zaobserwowania w wycieku plateau (obszar (3 na ryc. 1 C) o stężeniu składników identycznym, jak w mieszaninie wyjściowej. Wymywanie kontynuuje się przy użyciu buforu, przy czym na zstępującym ramieniu profilu elucji pojawia się drugie plateau (obszar y), którego poziom odpowiada równowagowemu stężeniu ligandu [L] (48, 49). Metoda jest stosowalna w przypadkach, gdy kompleks oraz wolne białko poruszają się w żelu z jednakową szybkością, znacznie jednak wyższą niż wolny ligand. Migracja kompleksu białkowego musi być ponadto niezależna od stężenia zarówno białka jak i ligandu (48). Nie jest konieczne jakiekolwiek uwzględnianie ewentualnego oddziaływania żel--ligand, gdyż w momencie ustalenia plateau pojemność wiążąca żelu zostaje wysycona w stopniu, odpowiadającym wartości równowagowego stężenia ligandu, lub całkowicie w przypadku adsorpcji nieodwracalnej. W odróżnieniu od metody Hummela i Dryera technika czołowa pozwala na badanie układów, w których kinetyka wiązania jest stosunkowo wolna. Ponieważ pomiary stężenia ligandu w obszarach plateau (3 i y wykonuje się w wielu frakcjach, wyznaczane wartości mogą być uśredniane i poddawane statystycznej analizie. Zapewnia to dużą precyzję oznaczenia (49).

Niewątpliwym ograniczeniem metody jest natomiast konieczność zużywania dużych ilości białka. W niektórych przypadkach można jednak