7808335476

8.    Dodanie do wszystkich studzienek 100 pl rozcieńczonego (1000x) roztworu

drugorzędowego przeciwciała skierowanego przeciwko IgE ludzkiej znakowanego enzymem (peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), inkubacja 1 h.

9.    Usunięcie roztworów ze studzienek i przepłukanie płytki buforem PBS (4 razy).

10.    Dodanie 100 pl substratu odpowiedniego dla danego enzymu TMB lub pNPP, inkubacja odpowiednio 1 h lub 0,5 h. Pojawi się reakcja barwna a jej intensywność świadczy o ilości badanego białka w próbie.

11. Dodanie 100 pl IM H2SO4 lub 3M NaOH w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej.

12.    Pomiar absorbancji przy długości fali odpowiednio X= 450 nm lub X= 495 nm.

IV. Opracowanie wyników

1.    Zawartość białka:

W oparciu o zależność absorbancji od stężenia białka obliczono:

zawartość białka w ekstrakcie = x[pg/ml] • rozcieńczenie ekstraktu zawartość białka w przyprawie = ( x[pg/ml] • rozcieńczenie ■ V )/m, gdzie:

x - wyznaczamy z równania krzywej wzorcowej sporządzonej dla albuminy: y=l,0233x + 0,0712

m - naważka v - objętość ekstraktu

2.    Immunoreaktywność ogólna:

I og.= (A-Ak)- rozc. ELISA • V ekstraktu, gdzie A - średnia wartość absorbancji próbki badanej Ak - średnia wartość absorbancji próby kontrolnej

3.    Immunoreaktywność właściwa - immunoreaktywność w przeliczeniu na białko:

1= I og. /B, gdzie

I og. - immunoreaktywność ogólna B - zawartość białka w badanych próbkach.