8009766951

Polimeraza DNA I (holoenzym) (Poił, polimeraza Komberga) syntetyzowana przez E. coli zbudowana jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 109 kDa, kodowanego przez gen po/A. Enzym ten posiada następujące aktywności: (i) polimerazy DNA 5’—»3’; (ii) egzonukleazy 3’—»5’; (iii) egzonukleazy 5’—*3’ oraz (iv) RNazy H. Aktywność RNazy H nie jest powszechnie wykorzystywana w biologii molekularnej. Poszczególne aktywności katalizowane są przez odrębne domeny enzymu (Tabela 6).

Tabela 6. Domeny polimerazy DNA I kodowanej przez Escherichia coli.

Domena	Aktywność
Karboksylowa, aminokwasy 543 - 928, ~46 kDa	polimeryzacyjną 5’—>3’
Centralna, aminokwasy 326 - 542, ~22 kDa*	egzonukleolityczną 3’—»5’
Aminowa, aminokwasy 1-325*	egzonukleolityczną 5’—»3’

♦karboksylowa i centralna domena stanowią fragment Klenowa

Fragment Klenowa jest dużym fragmentem polimerazy DNA I kodowanej przez E. coli. Posiada aktywność polimeryzacyjną 5’—>3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’—*5’ (aktywność naprawcza). W porównaniu z Poił nie posiada aktywności egzonukleolitycznej 5’—>3’. Do przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5’—>3’ wymagana jest obecność jednoniciowej matrycy oraz startera. Niezbędnym kofaktorem reakcji katalizowanych przez enzym są jony Mg²⁺. Fragment Klenowa jest monomerem o wielkości 76 kDa. Enzym ten można otrzymać poprzez proteolizę polimerazy Komberga subtylizyną lub też poprzez sklonowanie odpowiedniego fragmentu genu po/A w komórkach E. coli.

Fragment Klenowa jest wykorzystywany w biologii molekularnej m.in. do:

-    wypełniania lepkich końców 5’ (Ryc. 2.6), powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi pozostawiającymi tego typu końce. Enzym ten katalizuje w sposób zależny od matrycy dodawanie trifosforanów nukleotydów do cofniętej reszty hydroksylowej 3’. Synteza zachodzi w kierunku 5’—>3’do momentu, aż wystający lepki koniec zostanie całkowicie wypełniony.

5' . . .GTCCA 3' oh fragment Klenowa ^    5/ . . .GTCCAAGCT 3'_0H

3' . . .CAGGTTCGAp 5'    — _{dATp dTJp} ⁼u^^> 3' . . .CAGGTTCGAp 5'

dGTP. dCTP

Mg²⁺

Ryc. 2.6 Wypełnianie wystających lepkich końców 5’ przez fragment Klenowa.

-    wytępiania lepkich końców 3% które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi wystające końce 3’. Jednak wytępianie lepkich końców 3' jest wydajniej katalizowane przez polimerazę DNA faga T4, która ma większą aktywność egzonukleolityczną. W niektórych przypadkach aktywność egzonukleolityczną 3’—>5’ fragmentu Klenowa jest niepotrzebna lub szkodliwa. Należy wtedy zastosować fragment Klenowa exo’. Enzym ten zachowuje aktywność polimeryzacyjną, nie posiada natomiast aktywności egzonukleolitycznej 3’—»5\ Fragment Klenowa exo‘ uzyskuje się poprzez wprowadzenie odpowiedniej mutacji w genie kodującym fragment Klenowa.

20