AKTYWNOŚĆ

ENZYMATYCZNA

ĆWICZENIE 3

50

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

3. ENZYMY – AKTYWNOŚĆ I CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA NIĄ

3.1. Podstawy teoretyczne

3.2. Wykonanie ćwiczenia

A. Wykrywanie aktywności pepsyny

Wykonanie ćwiczenia:



Przygotować szereg kilku probówek (minimum 4; maxymalnie 6).



Do jednej z nich odmierzyć 2 ml kwaśnego roztworu kazeiny (w lodówce) i dodać
kilka kropel 10% roztworu AcONa (próba odniesienia).



Do kolejnej probówki odmierzyć: 10 ml kwaśnego roztworu kazeiny i 4 ml preparatu
Citropepsin; wstawić probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 40°C.



Po dwóch minutach pobrać pipetą 2 ml hydrolizatu z probówki i natychmiast
dodawać kroplami 10% roztwór AcONa. Kolejną (ostatnią) próbę wykonać po 12
minutach lub

opcjonalnie jeszcze maxymalnie 2 razy pomiędzy pierwszą i ostatnią

.

Zapisać obserwacje w tabeli 1.

Rysunek 1

Przygotowanie sprawozdania (część pierwsza):



Wypełnić tabelę 1 z obserwacjami.



Napisać do jakiej klasy enzymów należy pepsyna i jaki proces katalizuje.

51

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

SPRAWOZDANE (część pierwsza)

Obserwacje:
Tabela 1

Nr probówki

1

2

3

4

5

0’

2’

……..’

……..’

12’

Wnioski:

52

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

B. Wykrywanie aktywności inwertazy

Przed przystąpieniem do ćwiczenia B należy przygotować:

Roztwór inwertazy z drożdży: Drożdże świeże (0.5g) rozetrzeć w moździerzu
z piaskiem, dodać 200ml wody destylowanej, następnie przesączyć przez lejek.
Supernatant, zawierający inwertazę, stanowi materiał do ćwiczeń. Można również
wykorzystać roztwór inwertazy przygotowany przez grupę studentów wykonującą
ćwiczenie 4.

Wykonanie ćwiczenia:



Przygotować szereg 6 probówek.



W dwóch probówkach (A, B) umieścić po 3 ml 0.2 M roztworu sacharozy. Do
probówki B dodać 2 ml 10% roztworu NaOH.



Do czterech kolejnych (1-4) wlać po 3 ml odczynnika Benedicta.



Do pierwszej (1) z nich wlać 0.5 ml 0.2M roztworu sacharozy (próba odniesienia).



Do probówek A i B dodać 4 ml roztworu inwertazy z drożdży.



Po 3 minutach pobrać z probówki A 0.5 ml hydrolizatu i wprowadzić do probówki nr
2. Kolejną porcję hydrolizatu pobrać po 12 minutach i wprowadzić do probówki nr 3.



Po 12 minutach pobrać 0.5 ml hydrolizatu z probówki B i wprowadzić do probówki
nr 4.



Probówki 1-4 ogrzewać 3 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować obserwacje
w tabeli 2.

53

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

Rysunek 2

Przygotowanie sprawozdania (część druga):



Wypełnić tabelę 2 z obserwacjami



Do jakiej klasy enzymów należy inwertaza?? Napisz równania zachodzących reakcji.
Jeśli reakcja jest ‘typowym’ procesem redoks napisz jej bilans jonowo-elektronowy.

W równaniu reakcji zaznaczyć, który produkt był obserwowany podczas

przeprowadzania eksperymentu.



Jaki wpływ na aktywność enzymu ma zmiana pH środowiska?

54

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

SPRAWOZDANIE (część druga)

Obserwacje:
Tabela 3

Nr probówki

1

2

3

4

0’

3’

12’

12’

Wnioski:

55

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

C. Wykrywanie aktywności ureazy

Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy rozetrzeć kilka ziaren soi w moździerzu.

Wykonanie ćwiczenia:

Ziarna soi umieścić w 4 probówkach zgodnie z informacjami zawartymi w Tabeli 3.
Jedną probówkę ogrzewać przez kilka minut nad płaszczem grzejnym następnie
probówkę należy ostudzić. Do wszystkich probówek należy dodać jednocześnie po 5 ml
r-ru mocznika i dodać kilka (3-5) kropli fenoloftaleiny. Obserwuj zmianę intensywności
zabarwienia w czasie. Obserwacje zapisać w Tabeli 3.

Przygotowanie sprawozdania (część trzecia):



Zapisać obserwacje w tabeli 3.



Napisać do jakiej klasy enzymów należy ureaza oraz zapisać równanie katalizowanej
reakcji. Obecność jakich cząsteczek lub jonów jest odpowiedzialna za pojawienie się
zabarwienia roztworu w trakcie przeprowadzania doświadczenia.



Jak na przebieg reakcji enzymatycznej wpłynęło rozdrobnienie ziaren i ich prażenie.
Uzasadnij zmiany obserwowane zmiany.

56

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

SPRAWOZDANIE (część trzecia)

Tabela 3
próba ziarna

temp.

barwa (intensywność)

30s

20 min

50min

A

całe

-

B

roztarte -

C

roztarte prażone

Wnioski:

57

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

D.

Wykrywanie oksydaz, peroksydaz i katalaz

Przed przystąpieniem do ćwiczenia C należy przygotować:

Wyciąg ziemniaczany: umytą i obraną połówkę ziemniaka utrzeć na tarce. Miazgę
umieścić w zlewce z 150 ml wody i łagodnie zamieszać. Roztwór należy przesączyć.
Supernatant stanowi materiał do ćwiczeń. Uwaga!!! Czynności opisane należy wykonać
sprawnie, a do doświadczenia należy stosować świeży roztwór (nie posiadający
ciemnego, brązowego zabarwienia)

Wyciąg z korzenia chrzanu: wysuszony i starty korzeń chrzanu (lub chrzan dostępny w
sklepie) umieścić w kolbie stożkowej ze szlifem zadać kilkoma ml wody, dokładnie
wytrząsnąć przez kilka minut. Roztwór przesączyć lub zdekantować. Supernatant
stanowi materiał do ćwiczeń.

Wykonanie ćwiczenia:

Należy przygotować zestaw probówek zawierający substancje wymienione
w Tabeli 4. Obserwować zmiany w probówkach w czasie. Należy zwrócić szczególną
uwagę na zmianę zabarwienia w czasie i wydzielające się gazowe produkty. Następnie
zapisać obserwacje w Tabeli 4.

Przygotowanie sprawozdania (część czwarta):



Wypełnienie tabeli 4.



Do jakich klas lub klasy enzymów należą okzydaza/peroksydaza/katalaza.

Napisz równania katalizowanych reakcji. Jakie produkty były obserwowane
w próbach przeprowadzonych z użyciem fenolu i pirokatechiny (z dodatkiem i
bez dodatku H

2

O

2

)?



W jaki sposób na szybkość katalizowanej reakcji wpływa budowa substratu

(fenol lub pirokatechina)? Odpowiedź uzasadnij.



Jaki wpływ na przebieg reakcji enzymatycznej ma dodatek Na

2

S?



Wypełnić tabelę 5.

58

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

SPRAWOZDANIE (część czwarta)

Obserwacje:

Tabela 4

5ml

10 kropel

kilka

kropel

10

kropel

uwagi

obserwacje

próba

wyciąg z

fenol

Na

2

S

H

2

O

2

A

ziemniaka

fenol

-

-

B

ziemniaka pirokatechina

-

-

C

ziemniaka

fenol

-

+

H

2

O

2

dodać

natychmiast po

dodaniu fenolu

D

ziemniaka pirokatechina

-

+

E

chrzanu

fenol

-

+

obserwuj barwę

przed dodaniem

H

2

O

2

F

chrzanu

pirokatechina

-

+

G

ziemniaka

-

-

+

H

ziemniaka

-

+

+

59

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

Wnioski:

60

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ

Wnioski:
Tabela 5

próba

skład mieszaniny reakcyjnej

obecny enzym

oksydaza/peroksydaza/katalaza

A

wyciąg z ziemniaka + fenol

B

wyciąg z ziemniaka + pirokatechina

C

wyciąg z ziemniaka + fenol + H

2

O

2

D

wyciąg z ziemniaka + pirokatechina +H

2

O

2

E

wyciąg z chrzanu + fenol + H

2

O

2

F

wyciąg z chrzanu + pirokatechina + H

2

O

2

G

wyciąg z ziemniaka + H

2

O

2

H

wyciąg z ziemniaka + Na

2

S + H

2

O

2

----------

Enzymy obecne w wyciągu z ziemniaka:

Enzymy obecne w wyciągu z chranu:

61

Ćwiczenie 3

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UŁ